Определение видового состава планктонных бактерий бассейна реки Енисей молекулярно-генетическими методами и экспериментальное исследование их биогеохимических функций

• Автор: Колмакова, Олеся Владимировна
• Шифр специальности: 03.02.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Глава 1 Секвенирование следующего поколения и современные методы определения видоспецифичных биогеохимических функций бактериопланктона

1Л Секвенирование следующего поколения

1.2 Методы определения видоспецифичных биогеохимических функций бактериопланктона

1.2.1 Анализ функциональных генов, транскриптов и белков

1.2.1.1 Методы «-омика»

1.2.1.1.1 Метагеномика

1.2.1.1.2 Метатранскриптомика

1.2.1.1.3 Метапротеомика

1.2.1.1.4 Метаболомика
1.2.1.2 Амплификация геномов единичных клеток
1.2.2 Методы с добавками питательных веществ
1.2.2.1 Мечение стабильными изотопами
1.2.2.1.1 Анализ липидов
1.2.2.1.2 Анализ ДНК
1.2.2.1.3 Анализ РНК
1.2.2.2 Применение бромдезоксиуридина и йоднитротетразолия фиолетового для определения биогеохимических функций бактериопланктона
1.2.2.3 Методы, основанные на флуоресцентной гибридизации in situ
1.2.2.3.1 Комбинация микроавторадиографии с флуоресцентной гибридизацией in situ
1.2.2.3.2 Комбинация спектроскопии комбинационного рассеяния света, изотопных меток и флуоресцентной гибридизации in situ
1.2.2.3.3 Мультиизотопная визуализирующая масс-спектрометрия

1.2.2.3.4 Комбинация бета-микроимиджинга с флуоресцентной гибриди-
зацией in situ
1.2.2.4 Изотопные чипы
1.2.2.5 Метод фингерпринтов («отпечатков пальцев»)
1.3 Сравнение методов и выбор наиболее оптимального пути для решения поставленных задач
Глава 2 Материал и методы исследований
2.1 Река Енисей
2.2 Водохранилище Бугач
2.3 Методы исследования
2.3.1 Отбор проб бактериопланктона Енисея
2.3.2 Постановка экспериментов в МЭС
2.3.3 Отбор проб в ходе экспериментов
2.3.4 Выделение геномной ДНК
2.3.4.1 Бактериопланктон Енисея
2.3.4.2 Бактериопланктон МЭС
2.3.5 Амплификация фрагмента гена 16S рРНК
2.3.5.1 Бактериопланктон Енисея
2.3.5.2 Бактериопланктон МЭС
2.3.6 Получение библиотеки ампликонов участка гена 16S рРНК
2.3.7 Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК бакте-риоплактона Енисея методом секвенирования следующего поколения (NGS)
2.3.8 Биоинформатический анализ данных NGS
2.3.9 Определение численности бактериопланктона
2.3.10 Анализ изменений в составе бактериопланктона в МЭС методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза
2.3.11 Клонирование генов 16S рРНК бактериоплактона из экспериментов в МЭС
2.3.11.1 I эксперимент

2.3.11.2 IV эксперимент
2.3.12 Определение нуклеотидных последовательностей генов 16Б рРНК бак-териоплактона из экспериментов в МЭС
2.3.12.1 I эксперимент
2.3.12.2 IV эксперимент
2.3.13 Филогенетический анализ
Глава 3 Биоразнообразие и численность бактериопланктона р. Енисей
3.1 Численность
3.2 Альфа-разнообразие
3.3 Бета-разнообразие
3.4 Сравнение с другими реками
Резюме
Г лава 4 Экспериментальное изучение потребления аминокислот бактериопланк-тоном эвтрофного водохранилища
4.1 Июль 2004 (I эксперимент)
4.2 Август 2005 (II эксперимент)
4.3 Май 2006 (III эксперимент)
4.4 Август 2009 (IV эксперимент)
4.5 Май 2013 (V эксперимент)
Обсуждение
Резюме
Заключение
Выводы
Список литературы

терий, для последующего определения её нуклеотидной последовательности. Фингерпринтинг - полуколичественный метод, так как получаемые с его помощью профили сообществ подвластны потенциальным смещениям, вызванным ПЦР (неравномерная амплификация генов разных бактерий, образование химерных последовательностей). Полосы на профиле сообщества, соответствующие генам разных видов бактерий, напрямую не транслируются в таксономическую информацию, и предоставляют информацию только о самых многочисленных популяциях (Logue et al., 2008; Zajec et al., 2012). В настоящее время считается, что основанные на ДНК фингерпринты отражают наличие вида в сообществе, а РНК-фингерпринты соответствуют метаболически активным членам сообщества (Brettar et al., 2012).
Фингерпринтинг амплифицированных фрагментов гена 16S рибосомальной РНК с помощью DGGE - полезный подход для мониторинга изменений состава доминирующих видов внутри бактериальных сообществ в экспериментальных микроэкосистемах например, (Ovreas et al., 2003; Schafer et al., 2001; Колмакова, Трусова, 2011; Трусова, Гладышев, 2006; Трусова и др., 2012). Более того, фингерпринтинг позволяет изучать реакцию бактериальных сообществ не только на добавки органических веществ, но и на изменения других физических, химических и биотических факторов среды (Brettar et al., 2006; Brown et al., 2012).
Фингерпринты позволяют следить за изменением структуры бактерио-планктонного сообщества во время процесса потребления питательного вещества. Обычно вещество, потребление которого намереваются исследовать, добавляют непосредственно в пробу воды, содержащую всё планктонное сообщество. По увеличению яркости полос на профиле, соответствующих видам-потребителям данного вещества, следят за динамикой бактериального сообщества в ходе эксперимента. Популяции, не потребляющие добавленное вещество, остаются стабильными, плотность соответствующих им полос на профиле не изменяется. Некоторые исследователи используют DGGE совместно с другими методами, позволяющими отделить функционально активную часть сообщества, например, добавляя