Влияние экологических факторов на качественный и количественный состав микробиоты в почвах различных типов ландшафта

• Автор: Налян, Армен Григорьевич
• Шифр специальности: 03.02.08
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 145 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ГЛАВА 1. Состав и характеристика микробных сообществ почв (литературный обзор)
1.1. Бактерии
1.2. Археи
1.3. Эукариоты (грибы)
1.4. Современные методические подходы, применяемые для изучения почвенной микробиоты
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования
2.2. Лабораторный анализ
2.3. Математическая обработка результатов
ГЛАВА 3. Генетическая гетерогенность бактериальных сообществ почвы в зависимости от эдафических факторов
3.1. Выявление взаимосвязей между экологическими параметрами почвы
3.2. Анализ бактериальных сообществ в почве по результатам
пиросеквенирования ДНК генов 16Б рРНК
3.3. Изменения в структуре бактериальных сообществ в зависимости от почвенных факторов (по результатам денатурирующего градиентного гель-электрофореза ДНК генов 16Б рРНК)
Г ЛАВА 4. Г енетическая гетерогенность сообществ почвенных (микоризных) грибов ризосферы дикорастущих растений
4.1. Зависимость структуры сообществ ризосферных грибов от экологических факторов (по результатам пиросеквенирования ДНК генов ШрРНК)
4.2. Анализ арбускулярно-микоризных грибов при помощи метода
денатурирующего градиентного гель-электрофореза
Выводы
ЛИТЕРАТУРА
Приложения
Приложение
Приложение

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Микроорганизмы (грибы, водоросли, простейшие, бактерии, актиномицеты) являются важнейшим компонентом почвы и вносят значительный вклад в формирование структуры наземных экосистем (Звягинцев, 1987; Бахнов, 2002; Звягинцев, 2005). Масса почвенной микробиоты составляет большую часть общей массы всех микроорганизмов нашей планеты. Однако, сведения о биологии почвенных микроорганизмов, о видовом разнообразии, об их относительном обилии в различных типах почв, весьма ограничены (Алехина и др., 2002; Полянский и др., 2002; Добровольский, Никитин, 2006). Получение новых экспериментальных данных ограничивается тем, что до недавнего времени отсутствовали адекватные высокоинформативные методы исследования микроорганизмов почвы в естественной среде их обитания.
Как известно, большинство почвенных микроорганизмов не способны к культивированию в искусственных условиях вне их естественного места обитания (Muyzer et al., 1993). Соответственно, истинное количество видов микроорганизмов и их относительное изобилие в почве до сих пор не известны. Предполагается, что в почве могут обитать десятки тысяч видов бактерий, но лишь небольшая доля этих бактерий выделена и охарактеризована (Muyzer, Smalla, 1998; Whitman, Coleman, 1998; Ward, 2006). По оценкам некоторых авторов, разнообразие почвенных грибов может доходить до 1,5 млн. видов (Hawksworth, Rossman, 1997; Mueller, Schmit, 2007). Мало изученными остаются и вопросы, касающиеся количественного и качественного состава, структуры различных микробных сообществ в зависимости от физических и химических свойств почвы, при действии различных экологических факторов, таких как влажность, рельеф и т.д. Следует отметить, что в последние годы были разработаны молекулярно-генетические методы, позволяющие идентифицировать и определить разнообразие микроорганизмов в различных средах, включая и организмы, которые не поддаются изучению

при помощи традиционных микробиологических методов (Dunbar et al., 1999; Roesch et al., 2007). К таким методам относится технология параллельного высокопроизводительного пиросеквенирования, которая позволяет анализировать последовательности ДНК генов 18S и 16S рРНК (Rothberg, Leamon, 2008). Другой молекулярный метод денатурирующего градиентного гель -электрофореза продуктов ПЦР позволяет сравнивать состав различных микробных сообществ в целом, без таксономической идентификации (Muyzer, 1999).
В нашей работе были разработаны методические подходы, позволяющие использовать эти технологии для анализа генетического разнообразия сообществ почвенных микроорганизмов и оценки влияния факторов окружающей среды на состав и структуру этих сообществ.
Цели и задачи работы. Целью настоящей работы является определение генетического разнообразия и изобилия бактерий, грибов в почвах различных типов ландшафта и оценка степени влияния экологических факторов на качественный и количественный состав почвенной микробиоты.
Были поставлены следующие задачи:
• Разработка методических подходов применения денатурирующего градиентного гель - электрофореза и пиросеквенирования для измерения генетического разнообразия, идентификации (классификации) эукариотических и прокариотических организмов в почвенных образцах.
• Идентификация и таксономическая классификация почвенных микроорганизмов, в т.ч. и из ризосферы растений, по первичной последовательности ДНК (генов 18S и 16S рРНК).
• Определение относительного количества таксонов прокариот и выявление доминирующих групп организмов в бактериальных сообществах почв различных типов ландшафта в зависимости от экологических факторов.
• Определение относительного количества таксономических групп почвенных грибов и выявление доминирующих таксонов в ризосфере в зави-

ние калия и глины оказались коллинеарными. Некоторые экологические переменные, такие как относительное положение склона (РСТР08) отрицательно коррелирует с влажностью почвы и с индексом растительного покрова (УР^уре).
Рис. 3. Взаимосвязи между экологическими параметрами почв ландшафтов различных типов, полученных путем анализа главных компонент.
Примечание: Стрелки (векторы) указывают направления роста значений параметров. Векторы в одном направлении коррелируют друг с другом положительно, если они направленны противоположно - коррелируют отрицательно.
Из рисунка 3 видно, что образцы почв из одинаковых ландшафтов ха-рактеризируются схожими экологическими параметрами и на диаграмме формируют соответствующие кластеры. Так образцы почвы из затопляемых пойм четко отделены- от других образцов по горизонтальной оси, тогда как образцы из сухих возвышенностей (ВПС) расположены близко с образцами из умеренных склонов (УС). Следует отметить, что среди измеренных пара-