Шапероны Hsp60, Hsp70, Hsp100, Триггер Фактор и протеаза Lon как эффективные модуляторы активности люцифераз и белков LuxR мезофильных и психрофильных морских бактерий

• Автор: Горянин, Игнатий Игоревич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений и условных обозначений

Введение.

Актуальность темы исследования.

Цели и задачи.

Научная новизна.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Методология и методы исследования.

Положения, выносимые на защиту.

Степень достоверности и апробация результатов.

Структура работы

Обзор литературы.
Глава 1. Молекулярные шапероны.
1.1. Введение.
1.2. Шапероны семейства Hsp70.
1.3. Шапероны семейства Hsp90.
1.4. Шапероны семейства HsplOO.
1.5. Шапероны семейства HspöO.
1.6. Малые шапероны sHsp (IbpAB).
1.7. Триггер Фактор.
Глава 2. Участие шаперонов и протеаз в регуляции экспрессии генов /шс-оперонов люминесцирующих бактерий.
2.1. Структура /шг-оперонов морских бактерий мезофильных Aliivibrio fischeri и психрофильных Aliivibrio logei.
2.2. Участие бишаперонной системы DnaKJE-ClpB в рефолдинге термоинактивированных люцифераз (LuxAB).
2.3. Участие шаперонина GroEL/ES и протеазы Lon в сборке и деградации белка LuxR - активатора транскрипции генов lux-оперона А. fischeri.
Экспериментальная часть.
Глава 3. Материалы и методы исследования.
3.1. Бактериальные штаммы.
3.2. Среды, ферменты, реактивы.
3.3. Плазмиды.
3.4. Генно-инженерные методы.
3.5. Конструирование плазмид.
3.6. Измерение экспрессии интенсивности биолюминесценции.
3.7. Термоинактивация и рефолдинг люциферазы in vivo.
3.8. Выделение и очистка ТФ.
3.9. Рефолдинг бактериальной и светлячковой люцифераз in vitro.
Результаты и обсуждение.
Глава 4. Участие АТФ-зависимых шаперонов и протеаз в экспрессии
генов /идс-оперонов психрофнльных бактерий A. logei и мезофил ьных
A. fischeri.
4.1. Роль шаперонина GroEL/GroES в фолдинге активных форм белков
LuxRl и LuxR2 психрофнльных бактерий A. logei.
4.2. Влияние протеазы Lon на белки LuxRl и LuxR2 психрофнльных
бактерий A. logei.
4.3. Сравнение влияния шаперонина GroEL/GroES и протеазы Lon на
фолдинг и поддержание активных форм белка LuxR2 психрофнльных
бактерий A. logei и LuxR мезофильных бактерий A. fischeri.
4.4. Сравнение термостабильности и способности к рефолдингу
люцифераз психрофнльных бактерий A. logei и мезофильных бактерий
A. fischeri.
Глава 5. Триггер Фактор-зависимый рефолдинг бактериальных
люцифераз.
5.1. Основные характеристики Триггер Фактор-зависимого рефолдинга
термоинактивированных люцифераз.
5.2. Триггер Фактор осуществляет рефолдинг гетеродимерных, но не
мономерных люцифераз.
5.3. Сравнение шаперонной активности Триггер Фактора из мезофильных и психрофильных бактерий. 5.4. Обсуждение результатов, полученных при изучении Триггер Фактор-зависимого рефолдинга бактериальных люцифераз. 74
Заключение. Выводы. 87
Список литературы

Активность,'
-1 I I II

Время, мин
Рис. 12. Кинетика термоинактивации бактериальных люцифераз in vitro [130]. По оси ординат указана активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс - время термоинактивации, а. — Люциферазы Р. phosphoreum (1) и A.fischeri (2), температура инактивации 36°С; б. — люциферазы A.fischeri (1), V harveyi (2) и P. luminescens (3), температура инактивации 43,5°С..
На рис. 12 представлены кривые термоинактивации люцифераз, изолированных из нескольких видов люминесцирующих бактерий. Из сравнения, тангенса угла наклона кривых термоинактивации можно заключить, что при 36°С люцифераза Photobacterium phosphoreum примерно в 10 раз термолабильнее люциферазы A.fischeri (рис. 12, а), в то время как люцифераза наземных бактерий Photorhabdus luminescens (при 43,5°С) примерно в 15 раз термостабильнее люциферазы морских бактерий A. fischeri. Промежуточное положение по термостабильности занимает люцифераза Vibrio harveyi (рис. 12, б).
На рис. 13 приведены зависимости степени ренатурации люцифераз (% от исходного уровня) от времени инкубации при температуре рефолдинга.