Роль внеклеточной ДНК в функциональной активности генома человека

• Автор: Костюк, Светлана Викторовна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 450 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ (Внеклеточная ДНК - биологически активная молекула)

1.1. Свойства внеклеточной ДНК

1.1.1. Стандартизация методов выделения и хранения вкДНК

1.1.2. Концентрация вкДНК

1.1.3. Фрагментация вкДНК

1.1.4. Содержание различных последовательностей в составе вкДНК

1.1.5. Эпигенетические модификации вкДНК: метилирование фрагментов вкДНК

1.1.6. Окислительная модификация оснований вкДНК

1.1.7. Свойства вкДНК определяют ее характеристики как маркера при
патологии и при опасных для генома воздействиях
1.1.7.1. Применение вкДНК в качестве маркера ранней диагностики в
онкологии
1.1.7.2. Применение вкДНК в качестве маркера в пренатальной диагностике, трансплантологии и других областях диагностики
1.2. Происхождение вкДНК. Механизм появления вкДНК в циркуляции
1.3. Формы существования вкДИК
1.4. Биологическая активность вкДНК
1.4.1. ВкДНК как активатор иммунных реакций
1.4.2. ВкДНК как фактор стресс - сигнализации в индуцированном ионизирующей радиацией эффекте свидетеля
1.5. Способы проникновения вкДНК внутрь клетки
1.6. Внутриклеточные рецепторы, опознающие фрагменты вкДНК
1.6.1. Белки семейства TLR - сенсоры фрагментов вкДНК
1.6.1.1. Общая характеристика белков TLR
1.6.1.2. Природные и синтетические лиганды TLR9
1.6.1.3. Ингибиторы взаимодействия CpG -ДНК с TLR9
1.6.1.4. Механизм доставки лигандов к TLR, расположенным на эндосомах
1.6.1.5. Шапероны - роль в подготовке и перемещении TLR в эндосомы
1.6.1.6. Как иммунная система отличает нуклеиновые кислоты болезнетворных микроорганизмов и собственные нуклеиновые кислоты
1.6.2. Другие рецепторы - кандидаты на роль связывания вкДНК
1.6.2.1. ZBP1 или DAI — сенсоры цитозольной ДНК
1.6.2.2. Роль рецептора RIG1 в проведении сигнала от вкДНК
1.6.2.3. AIM2 и инфламмасома gg
1.7. Внеклеточная ДНК — индуктор окислительного стресса в клетках
1.7.1. Роль фермента N0X4 в синтезе активных форм кислорода, индуцированном вкДНК g
1.8. Внеклеточная ДНК принимает участие в регуляции клеточного цикла

1.9. Транскрипционные факторы и сигнальные пути, активирующиеся в клетках 96 при действии внеклеточной ДНК
1.9.1. Внеклеточная ДНК вызывает активацию транскрипционного фактора NF-

1.9.2. Внеклеточная ДНК вызывает активацию ядерного фактора NRF2
1.9.3. Взаимодействие между NRF2 - и NF-kB - сигнальными путями Ю
1.10. Заключение по данным литературы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Анализируемая выборка
2.2. Выделение внеклеточной ДНК
2.3. Определение концентрации и размеров фрагментов вкДНК
2.4. Определение содержания повторяющихся последовательностей генома в составе вкДНК Ю
2.5. Определение нуклеазной активности
2.6. Метод ИФА на ДНК-связывающих мембранах
2.7. Культивирование мезенхимных стволовых клеток (МСК) Ю
2.8. Культивирование ITUVEC (клеток эндотелия из вены пуповины)
2.9 Культивирование фибробластов
2.10. Выделение лимфоцитов
2.11. Приготовление образцов ДНК
2.12. Определение количества активных форм кислорода
2.13. Определение уровня окиси азота в клетках
2.14. Определение количества нитритов и нитратов (метаболитов окиси азота)
в среде культивирования j j j
2.15 Определение F-актина
2.16. Определение содержания 8-окси-7,8-дигидрогуанозина (8-oxoG) в 112 составе вкДНК
2.17. Определение одно- и двуцепочечных разрывов ДНК в клетках. Метод 112 ДНК-комет (single cell gel electrophoresis)
2.18. Определение двуцепочечных разрывов ДНК ядер клеток методом 112 иммунофлуоресценции
2.19. Анализ разрывов ДНК в клетках методом TUNEL
2.20. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH)
2.21. Определение ферментативной активности каспазы 3
2.22. Определение уровня экспрессии белков
2.23. Ингибирование TLR9 клеточного пути
2.24. Оценка уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени
2.25. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ н ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Свойства внеклеточной ДНК. Поиск свойств, определяющих
биологическую активность вкДНК

3.1.1. Концентрация вкДНК не может служить маркером хронического
низкоуровнего повреждающего воздействия или хронически протекающего патологического процесса
3.1.1.2. Концентрация вкДНК зависит от нуклеазной активности плазмы крови
3.1.2. Длины фрагментов вкДНК
3.1.3. Концентрация повторяющихся последовательностей генома человека в плазме крови
3.1.3.1. ГЦ-богатая последовательность рнбосомного повтора накапливается в составе вкДНК
3.1.3.2. Содержание АТ-богатой последовательности генома в циркулирующей вкДНК плазмы крови лиц, подвергавшихся 133 профессиональному хроническому воздействию ионизирующего излучения, снижено по сравнению с контрольной группой
3.1.4. Окислительная модификация вкДНК
3.1.5. Фрагменты рДНК, накапливающейся в составе вкДНК, образуют в крови комплексы с антителами
3.1.5.1 Титры антител к рДНК в выборке облученных лиц выше, чем в контрольной
3.2. Влияние внеклеточной ДНК на функциональную активность генома гистологически различных культивируемых клеток человека с разным
пролиферативным потенциалом
3.2.1. Общая схема эксперимента
3.2.2. Характеристика культивируемых клеток
3.2.3. Характеристика образцов вкДНК и модельных фрагментов
3.2.4. Локализация окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК в разных
типах клеток
3.2.5. Изменение уровня активных форм кислорода в разных типах клеток при действии окисленных и неокисленных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК 15^
3.2.5.1. Количество АФК в НГГУЕС определяется свойствами вкДНК
3.2.5.2. Синтез АФК в МСК при воздействии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК Щ
3.2.5.3. Окисленные фрагменты вкДНК индуцируют в раковых клетках
МСР7 кратковременный окислительный стресс
3.2.5.4. Изменение уровня активных форм кислорода в фибробластах при действии гДНК и гДНКокси
3.2.6. Окислительные модификации вкДНК индуцируют повышение уровня окислительных модификаций собственной ДНК в ядрах клеток 17$
3.2.7. Окисленные фрагменты вкДНК индуцируют кратковременную экспрессию N0X4 в разных типах клеток
3.2.8. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают быстро репарируемьте разрывы ДНК ядер клеток
3.2.8.1. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают в ядрах ЬШУЕС быстро репарируемые разрывы ДНК
3.2.8.2. Внеклеточная ДНК с измененными свойствами стимулирует образование и репарацию разрывов хроматина культивируемых мезенхимных 194 стволовых клеток человека

Концентрация (уровень гибели клеток)
"острый " процесс
Содержание маркера окислення 8-oxodG
уровень окислительного стресса
Содержание маркерных GC-ДНК или dG
тип процесса:
острый, хроническт'і
Рисунок 1.5. Циркулирующая внеклеточная ДНК - маркер при различных патологических состояниях, сопровождающихся повышенной гибелью клеток.
ВкДНК является прогностическим маркером выживания при терминальных состояниях в отделениях интенсивной терапии; повышение концентации вкДНК более, чем в 2 раза, является неблагоприятным прогнозом [Kung et al., 2012; Rhodes et al.,
2006]. Концентрация вкДНК в травматологии напрямую связана с тяжестью травмы, в первые часы после аварии концентрация вкДНК служит предиктором смертности с чувствительностью и специфичностью 100 % и 81 %, соответственно [Lo et al., 2000]. Прогностическое значение концентрации вкДНК также было показано у пациентов с острым инфарктом миокарда и острым инсультом [Borissoff et al., 2013; Chang et al., 2003; Rainer et al., 2003]. Показано увеличение уровня концентрации вкДНК в плазме крови в первые 48 часов после ожога: уровень вкДНК коррелирует с серьезностью поражения, определяемой по проценту площади поверхности поражения [El Messaoudi et al., 2013].
Не только острые состояния, характеризующиеся гибелью большого числа клеток, сопровождаются повышением уровня вкДНК: повышение концентрации вкДНК и органоспецифичной вкРНК характерно для ряда аутоиммунных заболеваний и сахарного диабета [Nielsen, 2012]. Диабетическую ретинопатию, которая является серьезным осложнением диабета, трудно обнаружить, однако повышение концентрации мРНК родопсина может служить маркером развивающейся диабетической ретинопатии [Swarup and Rajeswari, 2007]. Уровень вкДНК может быть биомаркером при серповидно-клеточной анемии, сопровождаемой гемолизом, вазоокклюзией и воспалением [Swarup and Rajeswari,
2007]. При пролонгированной микардиальной ишемии также обнаруживают повышенный