Модификации хроматина при инактивации X-хромосомы у грызунов

• Автор: Васькова, Евгения Андреевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 89 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список использованных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Мейотичсская инактивация половых хромосом в сперматогенезе у самцов млекопитающих

1.1.1. Феномен мейотической инактивации половых хромосом

1.1.2. Динамика модификаций хроматина половых хромосом на разных стадиях сперматогенеза

1.1.3. Постмейотический половой хроматин

1.1.4. Механизм мейотической инактивации половых хромосом

1.1.5 Экспрессия генов половых хромосом на мейотических и постмейотических стадиях

1.2 Феномен инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих
1.2.1 Динамика модификаций хроматина неактивной Х-хромосомы в онтогенезе самок плацентарных млекопитающих
1.2.2 Модификации хроматина неактивной Х-хромосомы при имиринтированной инактивации у сумчатых млекопитающих
1.2.3 Два типа факультативного гетерохроматина неактивной Х-хромосомы..
1.3 Механизмы, обеспечивающие установление модификаций неактивного хроматина
1.4 Мейотическая инактивация половых хромосом как возможный предковый механизм процесса импринтированной инактивации Х-хромосомы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Объект исследования
2.2. Методы работы с клеточными культурами
2.2.1. Состав культуральных сред и условия культивирования
2.2.2. Получение культур клеток
2.2.3. Замораживание клеток
2.2.4. Размораживание клеток
2.3. Приготовление препаратов метафазных хромосом

2.4 Приготовление препаратов мейотических и постмейотических стадий
сперматогенеза
2.5. Иммунофлуоресцентное окрашивание ядер и метафазных хромосом
2.6 ДНК флуоресцентная гибридизация in situ
2.6 Выделение РНК
2.7. Синтез кДНК методом обратной транскрипции
2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.9 Электрофорез ДНК в агарозном геле
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Модификации неактивного хроматина Х-хромосомы в составе полового тельца в процессе мейотического и постмейотического сайленсинга у полевки М. levis
3.2 Модификации хроматина неактивной Х-хромосомы в процессе
импринтированной инактивации у полевки М. levis
3.2.1 Получение и анализ линии ТС клеток полевки М. levis
3.2.2 Модификации хроматина в недифференцированных ТС клетках самки полевки М. levis
3.2.3 Модификации хроматина неактивной Х-хромосомы в процессе дифференцировки ТС клеток полевки М. levis
3.3 Модификации хроматина Y-хромосомы в недифференцированных
грофобластных стволовых клетках М. levis
3.4. Модификации хроматина неактивной Х-хромосомы в процессе
импринтированной инактивации у мыши М. musculus
3.5 Модификации хроматина при случайной инактивации Х-хромосомы у крысы R. norvégiens
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список использованных сокращений
ВКМ - внутренняя клеточная масса бластоцисты;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
ДМСО - диметилсульфоксид; кДНК - комплементарная ДНК; п.н. - пара нуклеотидов;
ПЦР -полимеразная цепная реакция; сМ — сантиморган;
ТС клетки - трофобластные стволовые клетки;
DAPI - 4 ,6 -диамидино-2-фенилиндол;
DMEM - среда Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco's modified Eagle's medium);
FBS - эмбриональная бычья сыворотка (fetal bovine serum);
FCS - эмбриональная сыворотка крови крупного рогатого скота (fetal calf serum);
FGF4 - fibroblast growth factor;
H3K4 - лизин в 4 положении гистона Н4;
НЗК9 — лизин в 9 положении гистона НЗ;
НЗК27 — лизин в 27 положении гистона НЗ;
Н4К5 - лизин в 5 положении гистона Н4;
Н4К8 - лизин в 8 положении гитона Н4;
Н4К12 — лизин в положении 12 гистона Н4;
Н4К16 - лизин в положении 16 гистона Н4;
Н4К20 — лизин в 20 положении гистона Н4;
MSCI — мейотическая инактивация половых хромосом (meiotic sex chromosome inactivation);
PBS - фосфатный буфер (phosphate-buffered saline);
PMSC — постмейотический половой хроматин (post meiotic sex chromatin); PRC1 - Polycomb repressive complex 1;
PRC2 — Polycomb repressive complex 2;

экспрессия генаXist (Plath et al., 2003; de Napoles et ah, 2004; Kohlmaier et ah, 2004). Аккумуляция макроН2А1.2, несмотря на то, что является одной из наиболее поздних модификаций хроматина, также зависит от транскрипта гена Xist (Csankovszki et al., 1999) и от клеточного цикла (выявляется в S и G1 фазе).
PRC1 функционирует в качестве ЕЗ лигазы, которая участвует специфически в моноубиквитинировании гистона Н2А. PRC1 комплекс состоит из 4 единиц, содержащих ЕЗ убиквитин лигазу (RING1A/R1NG1B или RING1B/RNF2). Убиквитинируется также макроША, содержащий домен, который специфически узнается убиквитин ЕЗ лигазой, включающей белки SPOP и CULLIN3, которые, взаимодействуя, формируют ЕЗ убиквитин-лигазу (Hemandez-Munoz et al., 2005).
Следует отметить, что связь неактивной Х-хромосомы с PRC2 и PRC1 является временной и наблюдается только в раннем эмбриогенезе. Какие ферменты и комплексы отвечают за поддержание триметилировапного НЗК27 и иН2А в соматических клетках до конца неизвестно. Существует предположение, что поддержание данных модификаций происходит с помощью тех же комплексов PRC, которые в ядре дифференцированных клеток содержатся в околоядрышковом районе, куда неактивная Х-хромосома перемещается на время репликации (Hemandez-Munoz et al, 2005; Zhang et ah, 2007).
Комплекс PRC1 содержит домен, узнающий триметилированный НЗК27. В связи с этим принято считать, что сначала на неактивной Х-хромосоме мыши появляется триметилированный II3K27, который узнается комплексом PRC1, осуществляющим убиквитинирование Н2А (de Napoles et al., 2004; Plath et al., 2004). Однако позже было установлено, что при запуске случайной инактивации в эмбриональных стволовых клетках убиквитинирование Н2А на неактивной X-хромосоме может происходить независимо от комплекса PRC2 и триметилировапного НЗК27 (Schoeftner et al., 2006).
Остается неизвестным, каким образом и с участием каких ферментов происходит формирование факультативного гетерохроматина неактивной X-хромосомы, содержащего триметилированный НЗК9 и гетерохроматиновый белок IIP 1. Роль белков НР1 в сайленсинге генов заключается в привлечении к сайтам связывания на хроматине DNMT, которые метилируют ДНК и тем самым регулируют транскрипцию (Smallwood et al., 2007). В геноме млекопитающих