Структура и функционирование 5"-регуляторной области гена NANOG восточно-европейской полёвки

• Автор: Сорокин, Михаил Алексеевич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 119 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Плюрипотентные клетки мыши

1.1.1 Развитие плюрипотентности в онтогенезе мыши

1.1.2 Плюрипотентные клетки мыши in vitro

1.1.3 Молекулярный контроль плюрипотентности у мыши

1.2 Функция гена Nanog

1.2.1 Nanog препятствует дифференцировке ЭСК, но не является

необходимым для поддержания их плюрипотентности
1.2.2 Nanog необходим для формирования «наивной» плюрипотентности
1.2.3 Nanog косвенно необходим для развития гипобласта
1.2.4 Nanog необходим для развития половой линии
1.2.5 Nanog завершает молекулярное in vitro репрограммирование

соматических клеток
1.2.6 Молекулярный механизм действия Nanog
1.3 Цис-элементы, регулирующие транскрипцию гена Nanog
1.3.1 Oct4 и Sox
1.3.2 Spl/Sp
1.3.3 Klf
1.3.4 Sall4 и Salll
1.3.5 FoxD
1.3.6 GCNF
1.3.7 Nanog и Zfp281 (прямая негативная авторегуляция)
1.3.8 p
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Объект исследования
2.2 Выделение геномной ДНК
2.3 Методы работы с РНК
2.3.1 Выделение РНК
2.3.2 Обработка РНК ДНКазой

2.3.3 Синтез кДНК
2.3.4 RACE
2.4 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК
2.5 Полимеразная цепная реакция
2.5.1 ОТ ПЦР
2.5.2 Инверс-ПЦР
2.6 Микробиологические методы работы
2.6.1 Приготовление компетентных клеток E. Coli
2.6.2 Трансформация компетентных клеток E. Coli
2.7 Методы работы с рекомбинантной ДНК
2.7.1 Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
2.7.2 Очистка плазмидной ДНК на колонках
2.7.3 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.7.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.7.5 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
2.7.6 А-тейлинг фрагментов ДНК
2.7.7 Лигирование фрагментов ДНК
2.8 Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.9 Методы работы с культурами эукариотических клеток
2.9.1 Состав культуральной среды и условия культивирования
2.9.2 Замораживание клеток
2.9.3 Размораживание клеток
2.10 Изучение активности репортёрных конструкций
2.10.1 Получение репортёрных конструкций
2.10.2 Временная трансфекция и измерение активности люциферазы
2.11 Бисульфитное секвенирование ДНК
2.11.1 Бисульфитная модификация ДНК
2.11.2 ПЦР с ДНК, модифицированной бисульфитом
2.12 Иммунофлуоресцентное окрашивание
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Структура и экспрессия генов Sox2, Klf4, Sall4, Esrrb и Мус полёвки
3.2 Сравнительный анализ последовательностей 5'-регуляторной области ^
гена Nanog млекопитающих
3.3 Определение потенциальных регуляторных элементов в 5'-регуляторной 80 области гена Nanog полёвки

1.2.6 Молекулярный механизм действия Nanog
Современные представления о механизме действия NANOG на транскрипционную машину плюрипотентности, главным образом, основаны на изучении «наивной» плюрипотентности ЭСК мыши, а также на результатах экспериментов по in vitro репрограммированию. Иммунопреципитация хроматина частично репрограммированных клеток выявила, что кооперативное связывание репрограммирутощих факторов ОСТ4, SOX2 и KLF4 нарушено в недорепрограммированных клетках, причём особенно в тех локусах, которые в «наивных» ЭСК являются мишенями NANOG. Это означает, что NANOG может выступать необходимым организующим кофактором связывания транскрипционных факторов плюрипотентности с их сайтами узнавания. Действительно, показано, что NANOG образует множественные белок-белковые связи с другими регуляторами плюрипотентности в ЭСК мыши (Wang, J. et ah, 2006). Репрограммирующие факторы ОСТ4, SOX2 и KLF4 взаимодействуют с NANOG (Orkin et al, 2008). Известно, что промоторы, связывающие множество факторов плюрипотентности, как правило, активны в ЭСК и инактивируются при дифференцировке (Kim, J. et al, 2008) — их активация при репрограммировании может зависеть от присутствия NANOG. В то же время глобальный анализ транскрипции в ЭСК с подавленной экспрессией Nanog показывает, что на множество своих транскрипционных мишеней NANOG оказывает репрессирующее действие как у мыши, так и у человека (Boyer et al, 2005; Loh et al, 2006). В экспериментах, анализирующих взаимодействие белков, NANOG прямо или опосредованно взаимодействует с разнообразными корепрессорными белковыми комплексами (Liang et al, 2008; Orkin et al, 2008). Таким образом, на финальных этапах репрограммирования Nanog, возможно, ещё и ингибирует альтернативные пути дифференцировки клетки.
1.3 Цис-элементы, регулирующие транскрипцию гена Nanog
Точная регуляция количества белка NANOG в клетке необходима в развитии, так как слишком низкий его уровень препятствует развитию плюрипотентности (Silva, J. et al, 2009; Miyanari, Torres-Padilla, 2012), а слишком высокий — делает невозможной нормальную дифференцировку плюрипотентных клеток (Chambers et al, 2003). В