Определение гена полифункционального пептида гуманина и белков, физически взаимодействующих с ним

• Автор: Максимов, Вадим Владимирович
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Митохондрии и рак. Эффект Отто Варбурга и гипотеза Отто Варбурга об этиологии рака: современный взгляд

1.2 Длинные некодирующие РНК и онкогенез

1.2.1 Доказательства существования большого класса генов, кодирующих

длинные некодирующие РЖ

1.2.2 Длинные некодирующие РНК в онкогенезе

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Рекомбинантные конструкты

2.2 Культивирование кишечной палочки E. coli
2.3 Культивирование дрожжей
2.4 Культивирование клеток млекопитающих
2.5 Иммунопреципитация и Вестерн-блот
2.6 Выделение тотальной клеточной РНК и нозерн-блот
2.7 Биоинформационные методы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Биоинформационный анализ митохондриального гена, кодирующего 16S рРНК человека, на наличие открытых рамок (ОРС)

3.2 Идентификация белков, физически взаимодействующих с гуманином, методом дрожжевого двухгибридного скрининга
3.3 Подтверждение физического взаимодействия гуманина с фосфобелком М-фазы 8 (ФБМФ8) методом ко-иммунопреципитации сверхэкспрессированных белков из клеток млекопитающих и картирование участков гуманина и ФБМФ8, отвечающих за это взаимодействие
3.4 Аминокислотная последовательность гуманина и/или нуклеотидная последовательность его ОРС содержат сигнал, значительно уменьшающий экспрессию на уровне белка, но не РНК
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Человеческая митохондриальная 16Б рибосомальная РНК как пример длиной «некодирующей» РНК, которая кодирует, как минимум, один пептид
4.2 Физические взаимодействия гуманина со многими белками могут быть необходимы для осуществления его разнообразных биологических функций
4.3 Физическое взаимодействие гуманина с ФБМФ8 может вовлекать гуманин в метастазирование и эпигеномную регуляцию экспрессии генов
4.4 Регулирование экспрессии гуманина и гены, осуществляющие это
регулирование, могут быть вовлечены в канцерогенез
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ!

ПРИЛОЖЕНИЕ
В остальном состав этих синтетических сред идентичен. В состав жидкой среды не входит агар. Все среды стерилизовали автокловированием.
Трансформацию дрожжей библиотекой прэев проводили согласно следующему протоколу. 5-6 колоний дрожжей засевали в 50 мл жидкой среды УРО и инкубировали в течение 16-18 часов с покачиванием при 30°С. Часть полученной ночной культуры дрожжей пересевали в 300 мл жидкой среды УРБ до оптической плотности СЮ6оо = 0,15 и инкубировали при 30°С с покачиванием до оптической плотности СЖ60о = 0,5-0,7 (логарифмическая фаза роста). Дрожжи осаждали центрифугированием (1000g, 5 минут) и промывали 30 мл стерильной воды. После повторного центрифугирования (1000§, 5 минут) дрожжи суспендировали в 1,5 мл буффера ТЕ с 0,1 М ацетатом лития (pH = 7,5). К полученной суспензии дрожжей добавляли 30 мкг билиотеки и 15 мг денатурированной дроблённой геномной ДНК лосося (ДНК-носитель). После смешивания дрожжевую суспензию с ДНК аликвотили на 30 пробирок (примерно 60 мкл в каждую пробирку). К каждой пробирке добавляли 300 мкл 40% ПЭГ-4000 в буффере ТЕ с 0,1 М ацетатом лития (pH = 7,5) и смешивали многократным переворачиванием. После 30 минут инкубирования в каждую пробирку добавляли 40 мкл ДМСО, смешивали перемешиванием и проводили тепловой шок в течение 10 минут при 42°С. После теплового шока клетки осаждали цетнтрифугированием (1000g, 5мин), инкубировали в жидкой среде УРБ в течение 1 часа и высевали на чашку Петри с соответствующей селективной средой. Для трансформации отдельных плазмид использовали в 30 раз меньше дрожжевых клеток 0,1-1 мкг плазмиды и 0,5 мг денатурированной дроблённой геномной ДНК лосося. Для трансформации линеаризованным вектором р.Ю4-5 и амплифицированной кДНК прэя использовали 100 нг линеарезованного вектора рЮ4-5, 1 мкг амплифицированной ДНК и 0,5 мг денатурированной дроблённой геномной ДНК лосося.