Определение компонентов комплексов белка SUUR Drosophila melanogaster

• Автор: Посух, Ольга Витальевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 121 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Регуляция репликации
1.1.1. Регуляция общей продолжительности Б-фазы в клеточном цикле
1.1.2. Регуляция эндоциклов
1.1.3. Контроль временной картины репликации
1.2. Организация хроматина
1.2.1. Типы состояния хроматина
1.2.2. НР1-зависимый гетерохроматин
1.2.3. РЫусошЬ-зависимый гетерохроматин
1.3. Регуляция времени репликации в контексте хроматина
1.3.1. Влияние хроматиновых факторов на скорость репликации
1.3.2. Белки ремоделинга хроматина
1.3.3. Гистоновые шапероны
1.4. Недорепликация
1.5. Белок БЕЛЖ в контексте репликации и хроматина
1.5.1. Б1ЛЖ - хроматиновый белок
1.5.2. Участие БиШ в регуляции репликации
1.6. Подходы к выявлению белковых взаимодействий и изучению белковых комплексов
1.6.1. Применение различных методов для обнуружения новых белковых взаимодействий
1.6.2. Метод двойной аффинной очистки белковых комплексов
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Создание системы для изучения взаимодействий белка Б1ЛЖ
3.1.1. Создание конструкций для экспрессии БСДЖ-ТАР
3.1.2. Получение линий мух и клеточной линии, экспрессирующих БииК-ТАР
3.1.3. Анализ функциональности химерного белка Би1Ж-ТАР
3.2. Б1ЛЖ взаимодействует с репликационной машиной
3.2.1. Проверка физического взаимодействия Б1ЛЖ и РСЫА
3.2.2. Связывание Б1ЛЖ с политенными хромосомами не зависит от РС1ЧА
3.3. Выделение белковых комплексов БииЯ-ТАР
3.3.1. Выявление компонентов комплексов Б1ЛЖ-ТАР
3.2.2. Идентификация белков ассоциированных с Б1ДЖ-ТАР
3.4. Анализ генетических взаимодействий Б1ЛЖ
3.4.1. Поиск влияния на хромосомную локализацию БТЛЖ
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ак. - аминокислота
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖТ - жировое тело
ИП - иммунопреципитация
кДІІК - комплементарная ДНК
М - маркер молекулярного веса
мРНК - матричная РНК
п.н. - пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
СЖ - слюнные железы
ТХУ - трихлоруксусная кислота
СВР - calmodulin binding protein
Cdk - cyclin dependent kinase
FPLC - fast protein liquid chromatography
ORC - origin recognition complex
PCNA - proliferating cell nuclear antigen
TAP - tandem affinity purification
UAS - upstream activating sequence
RNAi - RNA interference

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Реализация эпигенетической программы в развитии эукариотических организмов является на данный момент одной из наиболее изучаемых проблем современной биологии. То или инос состояние отдельных участков генома (эухроматиновое или гетерохроматиновое) эпигенетически наследуется в ряду клеточных поколений.
Было показано, что эухроматиновыс и гетерохроматиновые районы реплицируются неодновременно. Параметры пространственно-временной картины репликации генома четко контролируются в клеточном цикле. Однако многие аспекты регуляции такой дифференцированной программы остаются невыясненными.
У Drosophila melanogaster временная картина репликации в политенных тканях имеет свои характерные особенности: в силу укороченного общего времени S-фазы поздно реплицирующиеся гетерохроматиновые районы политенных хромосом слюнных желез не успевают завершить свою репликацию до конца S-фазы и последовательности ДНК в них остаются недопредставленными.
У D. melanogaster фактором, влияющим на регуляцию времени репликации таких районов в политенных хромосомах слюнных желез личинок, является белок SUUR {Suppressor of Underreplication). Он способен связываться с районами прицентромерного и интеркалярного (расположенного в плечах хромосом)
что приводит к уменьшению размеров слюнных желез за счет значительного снижения плоидности ядер. При эктопической экспрессии гена SuUR в фолликулярных клетках (драйвер C323-GAL4) происходит нарушение амплификации хорионовых генов, в результате чего самки в потомстве от такого скрещивания оказываются стерильными из-за нарушений формирования хориона. Повсеместная экспрессия (драйвер da-GAL4) SuUR ингибирует личиночный рост и приводит к летальности (Volkova et al, 2003; Kolesnikova et al., 2005).
В рамках изучения влияния мутации SuUR на более раннее завершение репликации было сделано предположение, что мутация SuUR может приводить к перераспределению связывания ORC в поздно реплицирующиеся районы. Однако, это предположение было опровергнуто, так как связывание ORC при мутации SuUR не отличалось от нормы (Sher et al., 2012).
Самым интригующим свидетельством влияния SUUR на репликацию являются данные о том, что SUUR способен замедлять движение вилки репликации при амплификации хорионовых генов (Sher et al., 2012). Совсем недавно удалось обнаружить, что SUUR практически полностью колокализуется на политенных хромосомах с PCNA, ключевой структурной компонентой вилки репликации, во время поздней репликации в слюнных железах (Kolesnikova et al., 2012). Но основной вопрос заключается в следующем - вызван ли эффект SUUR взаимодействием с вилкой репликации или изменением структуры хроматина, что препятствует ее движению? Колокализация с PCNA делает этот белок первым кандидатом на проверку физического взаимодействия с SUUR, что будет одной из основных целей этой работы.