Генетическая модификация штаммов Escherichia coli, направленная на получение продуцентов бутирата и бутанола

• Автор: Серегина, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микробиологический синтез бутанола

1.1.1. Биосинтез бутанола в клетках Clostridium acetobutilicum

1.1.2. Ферменты, участвующие в АВЕ ферментации

1.1.3. Генно-инженерный инструментарий для модификации

метаболизма клостридий

1.1.4. Стратегии увеличения продукции бутанола у клостридий

1.1.5. Альтернативный путь биосинтеза бутанола и других спиртов

1.1.6. Альтернативные штаммы-продуценты бутанола

1.1.7. Потенциальные возможности биосинтеза бутанола в
клетках E.coli
1.1.8. Путь /3-окисления жирных кислот в клетках E.coli
1.1.9. Ферменты пути [3-окисления жирных кислот
1.1.10. Рост E.coli на этаноле и бутаноле, как источниках углерода
1.2. Проблема устойчивости бактерий к бутанолу
1.2.1. Уровни толерантности к бутанолу у различных
микроорганизмов
1.2.2. Стрессовое воздействие бутанола
1.2.3. Механизмы устойчивости к бутанолу у клостридий
1.2.4. Устойчивость E.coli к органическим растворителям
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Среды и условия культивирования

2.3. Фенотипические характеристики культур штаммов E.coli
2.3.1. Определение устойчивости к бутанолу стационарных культур
штаммов E.coli
2.3.2. Определение осмотической толерантности
2.3.3. Определение устойчивости к антибиотикам
2.3.4. Определение состава жирных кислот целых клеток
2.3.5. Суперэкспрессия белков холодового шока
2.4. Манипуляции с ДНК
2.5. Выделение фракции белков внешней мембраны
2.6. Конструирование транскрипционных слияний
2.7. Измерение активности ß-галактозидазы
2.8. Мутагенез
2.9. Получение делеций целевых генов
2.10. Амплификация фрагментов для Red-зависимой рекомбинации
2.11. ПЦР
2.12. Red-зависимая рекомбинация ПЦР-фрагментов
2.13. Электропорация
2.14. Выщепление CmR маркера
2.15. Секвенирование
2.16. Определение метаболитов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
ЗЛ. Конструирование штамма E.coli, продуцирующего бутират без использования чужеродных генов
3.1.1 Инактивация гена fadR
3.1.2. Инактивация гена aceF

3.1.3. Получение асОгЕ мутантов Е.соИ, способных расти на этаноле в аэробных условиях
3.1.4. Идентификация мутаций в гене асИгЕ
3.1.5. Получение мутантов, растущих на бутирате и бутаноле, как единственных источниках углерода
3.1.6. Восстановление функционального аллеля гена асеЕ
3.1.7. Подстановка гена а1оВ под контроль промотора Р,е,
3.1.8. Инактивация генов ШИА и рШ, ответственных за синтез побочных продуктов при ферментации глюкозы в бутират и бутанол
3.1.9. Содержание продуктов ферментации глюкозы в культуральной среде
3.2. Фенотипические свойства бутанол-толерантного мутанта
3.2.1. Направленная микроэволюция штаммов в средах, содержащих бутанол
3.2.2. Устойчивость к бутанолу культур Е.соИ в стационарной фазе
3.2.3. Устойчивость к спиртам
3.2.4. Чувствительность к антибиотикам
3.2.5. Оксидативный стресс
3.2.6. Чувствительность к осмотическому шоку
3.2.7. Различия в липидном составе мембран штаммов МС1655 ВшЯ и Маб55
3.2.8. Влияние ионов Са2+ на устойчивость к бутанолу
3.2.9. Влияние суперэкспрессии белков холодового шока на устойчивость к бутанолу
3.3. Бутанол как фактор регуляции экспрессии гена отрС в клетках Е.соИ

районе гена dnaK C. acetobutylicum, включающий grpE, dnaK, dnaJ и новый ген теплового шока, кодирующий неизвестный белок. DnaK, белковый продукт гена dnaK, может повышать толерантность C. acetobutylicum к растворителям, который индуцируется во время сольвентогенеза. Другие три белка теплового шока могут выполнять сходные с DnaK функции, но для подтверждения этих предположений необходимы детальные исследования.
Стратегия индуцирования спонтанных мутаций под действием высоких концентраций бутанола так же применялась для повышения толерантности (92). Однако механизм такой толерантности нуждается в расшифровке, несмотря на то, что бутанол-толерантные мутанты обнаруживают способность захватывать глюкозу более эффективно посредством необычных нефосфотрансферазных систем в процессе сольвентогенеза (93). Изменение способа транспорта глюкозы предполагает изменение композиции мембраны, что возможно сопряжено с толерантностью клостридий к бутанолу. Было показано, что экспонирование клостридий в среде с бутанолом приводи к увеличению количества насыщенных жирных кислот в мембране клетки (74).
Наличие систем транспорта бутанола или деградация токсичного бутанола также способствуют толерантности клостридий к бутанолу (90).
В настоящее время обнаруживают все больше и больше генов, связанных с толерантностью к растворителям, механизм действия которых пока остается неясен.
1.2.4. Устойчивость E.coli к органическим растворителям
E.coli обнаруживает повышенную чувствительность к большинству
органических растворителей, поэтому было проведено множество
исследований по повышению ее толерантности. В литературе описан ряд
мутантов E.coli, устойчивых к различным органическим растворителям (п-
октанолу, n-гексану и т.д.), а так же рассмотрены некоторые механизмы этой
устойчивости (94). Показано, что увеличение толерантности в п-октанолу