Эпигенетическая характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

• Автор: Шутова, Мария Владимировна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 88 с. : ил.

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)

1.1. Общая характеристика

1.2. Поддержание шиорипотентности: молекулярные механизмы

1.2.1. Транскрипционные факторы, связанные с поддержанием шиорипотентности в ЭСК

1.3. Поддержание шиорипотентности: эпигенетические механинизмы

2. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

2.1 Способы получения

2.2 Общая характеристика индуцированных плюрнпотентных клеток

2.3 Индукция шиорипотентности: молекулярные и эпигенетические механнзмы
2.3.1 Транскрипционные факторы, участвующие в репрограммировании
2.3.2 Взаимодействие транскрипционных факторов во время
репрограммирования
2.3.3 Изменение эпигенетического статуса при репрограммировании
2.4 Сравнение iPS клеток и ЭСК
2.5 Практическая значимость технологии получения iPS клеток
Материалы и методы
Ферменты и реактивы
Клеточные линии
Культивирование клеток HUVEC
Приготовление фидерного слоя мышиных эмбриональных фибробластов
Приготовление покрытых матриксом культуральных чашек и планшетов
Культивирование ЭСК человека
Формирование и культивирование эмбриоидных телец
Дифференцировка ЭСК человека в клетки нейронального пути

Тест на образование тератом
Протокол по получению вирусных частиц для репрограммирования клеток
Репрограммирование клеток HUVEC
Иммуномагнитная сепарация - MACS (Magnetic cell sorting)
Тест на матрнгеле (Matrigel Assay)
Иммуноцитохимический анализ
Окраска антителами клеточных культур
Окраска антителами срезов эмбриоидных телец
Видеомикроскопия
Компьютерный анализ (определение сайтов рестрикции, выбор зондов, выбор праймеров)
Агарозный гель-электрофорез ДНК
Выделение хромосомной и плазмидной ДНК
Выделение тотальной РНК из клеточных культур
Реакция обратной транскрипции
Полимеразная цепная реакция
Анализ кариотипа и STR анализ
Полногеномный анализ метилирования ДНК
Получение клонов ЭСК человека, устойчивых к неомнцину
Индукция трансгенов в клонах ЭСК с помощью доксициклина
Бисульфитное секвенирование
Анализ протеома
Результаты и обсувдение
1. Репрограммирование эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC)
1.1. Характеристика endo-iPS клеток
1.2. Анализ кариотипа и уровня пролиферации линий endo-iPS
1.3. Дифференцировочный потенциал endo-iPS клонов
1.4. Анализ CpG метилирования endo-iPS
2. Создание модельной системы для изучения процесса репрограммирования
2.1. Получение генетически модифицированной линии ЭСК, содержащей ТФ Ос14, вох2, КЬР4, с-Мус под индуцируемыми промоторами
2.2. Дифференцировка линии ЬЕ8М05пео2 в нейросферы
2.3. Использование индуцибельной системы для репрограммирования нейральных клеток
2.4. Характеристика пеиго-|Р82
Заключение
Выводы
Список литературы

Sigma) мышиные эмбриональные фибробласты (МЭФ), посаженные на обработанные 0.1% желатином (Sigma) чашки Петри. Культуральная среда «среда для ЭСК» состояла из 80% КО DMEM, 20% КО SR, 1 мМ глютамина, 1% заменимых аминокислот, 50 ед/мл пенициллина, 50 ед/мл стрептомицина (все - из Invitrogen), 0.1 мМ бета-меркаптоэтанола (Sigma). В другом случае, клетки оставляли на матригеле, но на шестой день среду для HUVEC меняли на mTeSRl (StemCell Technologies). Половина среды меняли каждый день. Через двадцать дней после инфекции колонии iPS клеток вручную отделяли от фидера и пересевали на покрытую матригелем или фидером 24-луночную плашку в mTeSRl или «среде для ЭСК», соответственно.
На ранних пассажах клетки iPS пересевали вручную, на более поздних - с помощью коллагеназы IV (1мг/мл) или диспазы (1мг/мл). Для определения времени удвоения примерно 20,000 клеток были посажены на 24-луночную плашку, покрытую матригелем. Через 48, 72, и 96 часов после пересева клетки трипсинизировали и подсчитывали. Каждую временную точку подсчитывали трижды.
Иммупомагнитная сепарация - MACS (Magnetic cell sorting).
Для выделения CD31+ клеток, клетки, растущие на чашках, покрытых коллагеном IV
на 5 или 8 день, диссоциировали обработкой 0.05% трипсин/ЭДТА(Нус1опе) при 37°С в течение 10 мин,после инактивации трипсина 5% сывороткой дважды промывали PBS, содержащим 0.5% BSA, инкубировали 30 мин с мышиными антителами против CD31 человека (BD) и затем с IgG козы против мыши, пришитыми к магнитным шарикам (Miltenyi Biotec) в .течение 15 мин при 8°С. После каждого этапа клетки дважды промывали PBS, содержащим 0.5% BSA. Для получения фракции CD31 позитивных клеток производили элюцию на колонке (Miltenyi Biotec) прикрепленной к магнитному блоку Mini-MACS separation unit (Miltenyi Biotech), согласно рекомендациям производителя.
Тест на матригеле (Matrigel Assay).
0,5-2х104 клеток высевали на лунки, покрытые матригелем (BD) в 0,05 мл ростовой
среды для эндотелия, инкубировали 12 часов - при 37°С, 5% СО,. Морфологию клеток анализировали в фазовом контрасте на инвертированном световом микроскопе (Nikon Eclipse TS100F).
Иммуноцитохимический анализ.
Для иммуногистохимического анализа использовали следующие антитела: первичные
(Таблица А и вторичные (goat anti-mouse Alexa Fluor 488 или 546 Ig , goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 или 546-Ig (Molecular Probes)).