Новая ациламидаза из Rhodococcus erythropolis - свойства, гетерологичная экспрессия и практическое применение

• Автор: Лавров, Константин Валерьевич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Амидазы: распространённость и свойства

2.1.1.Субстратная специфичность амидаз

2.1.1.1. Алифатические амидазы

2.1.1.2. Стереоселективные амидазы

2.1.2. Гидролиз амидазами 1Ч-замещённых амидов

2.1.3. Аминокислотные последовательности амидаз

2.1.3.1. Алифатические амидазы
2.1.3.2. Стереоселективные амидазы
2.1.4. Особенности биосинтеза амидаз микроорганизмов
2.2. Гидролитические ферменты, катализирующие ацилирование аминов
2.2.1. Амидазы -
2.2.2. Пенициллин-ацилазы
2.2.3. Протеиназы
2.2.4. Липазы
2.3. N-замещённые акриламиды: применение и способы получения
2.3.1. Свойства и применение М-изопропилакридамида
2.3.2. Химические методы получения М-замещённых акриламидов
2.3.3. Перспективы биокаталитических способов получения М-замегцснных акриламидов
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.2. Коллекция природных микроорганизмов
3.3. Почвенные образцы, использованные для выделения штаммов
3.4. Среды для культивирования
3.5. Штаммы, плазмиды
3.6. Спекгрофотометрические измерения
3.7. Выделение культур бактерий из образцов почвы
3.8. Трансформация ИПАА нерастущими клетками бактерий

3.9. Определение ИПАА и продуктов его трансформации
3.10. Синтез ИПАА из акриламида и изопропиламина нерастущими клетками
бактерий
3.11. Измерение ациламидазной активности клеток с 4'-нитроацетанилидом
3.12. Измерение активности бесклеточных экстрактов и очищенной ациламидазы с 4'-нитроацетанилидом
3.13. Определение субстратной специфичности ациламидазы
3.14. Определение аминокислотной последовательности
3.15. Анализ последовательностей
3.16. Конъюгационнос скрещивание Rhodococcus erythropolis ТА37 и E. coli S17-1
3.17. Методики работы с ДНК
3.18. Методики работы с белками
3.19. Гстсрологичная экспрессия в E. coli
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
.4.1. Скрининг микроорганизмов, способных гидролизовать амидную связь в N-изопропилакриламиде.
4.1.1. Скрининг микроорганизмов по росту на изопропилакриламиде.
4.1.2. Способность штаммов, растущих на ИПАА, трансформировать изопропилакриламид до и-пропиламина и акриловой кислоты.
4.2. Выбор лучшего штамма, катализирующего синтез N-изопропилакриламида.
4.2.1. Динамика синтеза ИПАА лучшими штаммами - гидролитиками ИПАА
4.2.2. Идентификация штамма ТА37, проявляющего максимальную активность ациламидазы
4.3. Изучение особенностей биосинтеза ациламидазы и оптимизация условий, обеспечивающих максимальную активность клеток R. erythropolis ТА37.
4.3.1. Индукторы ациламидазы
4.3.2. Локализация ациламидазы в клетке.
4.3.3. Электрофоретическое исследование белков штамма Л. erythropolis ТА37
4.3.4. Условия, обеспечивающие максимальную активность клеток Д. erythropolis ТА37.
4.4. Выделение новой ациламидазы и изучение её каталитических свойств.
4.4.1. Методика контроля активности ациламидазы по гидролизу 4'-

нитроацетанилида.
4.4.2. Выделение и очистка ациламидазы.
4.4.3. Влияние температуры на активность и стабильность ациламидазы.
4.4.4. Влияние pH на активность и стабильность ациламидазы.
4.4.5. Влияние реагентов и ионов металлов на активность ациламидазы.
4.4.6. Субстратная специфичность ациламидазы.
4.5. Клонирование гена, кодирующего ациламидазу, секвенирование и анализ последовательности.
4.5.1. Определение частичной аминокислотной последовательности.
4.5.2. Клонирование ациламидазы и характеристика последовательности
4.5.2.1. Клонирование ациламидазы на векторе pTZ57R/T
4.5.2.2. Анализ последовательности ациламидазы.
Общая гомология аминокислотной последовательности
Общая гомология нуклеотидной последовательности
Множественное выравнивание аминокислотной
последовательности
4.6. Интегративная инактивация гена ациламидазы в R. erythropolis ТА37 и проверка фенотипа мутантов.
4.6.1. Интегративная инактивация
4.6.2. Рост штамма с инактивированной ациламидазой на N-замещённых и незамещённых амидах
4.7. Гетерологичная экспрессия гена, кодирующего ациламидазу, в E. coli
4.7.1. Экспрессия под лактозным промотором
4.7.2. Экспрессия под промотором фага Т7
4.7.3. Спектр гидролитической активности рекомбинантной ациламидазы
4.8. Разработка процесса биокаталитического синтеза N-замещённых акриламидов с использованием новой ациламидазы.
4.8.1. Оптимизация условий биокаталитического синтеза
4.8.2. Получение кристаллически чистого N-изопропилакриламида
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Высокая температура и длительное время синтеза приводят к присоединению аминов по двойной связи акриламидного остатка, в результате чего образуются побочные продукты - N-замещённые Р-алкиламиноакриламиды. Для снижения выхода побочных продуктов применяют ряд подходов:
Присоединение к двойной связи защитных групп перед ацилированием и удаление их после синтеза N-замещённого амида (рис. 12, а,б,в) (Dahmen et al., 1987; Landscheidt, 1986)
Допущение присоединения амина по двойной связи, а затем удаление образовавшейся р-алкиламиногруппы при высокой температуре (рис. 12, г,д) (Moss et al., 1975) Использование для ацилирования р-замещешгых производных пропионилхлоридов с последующим удалением р-замещающей группы, (рис. 12, д) (Goossens et al., 1985).

Рис. 12.
Способы защиты двойной связи
замещённых
при химическом синтезе N-
акриламидов.