Внеклеточная ДНК - фактор сигнализации при радиационном эффекте свидетеля

• Автор: Конькова, Марина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 154 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ЧАСТО ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Малые дозы радиации ’

1.2. Радиационно-индуцированный адаптивный ответ

1.3. Эффект свидетеля

1.4. Окислительный стресс

1.5. Апоптоз

1.6. Внеклеточная ДНК человека

1.6.1. Происхождение внеклеточной ДНК в организме человека
1.6.2. Концентрация внеклеточной ДНК
1.6.3. Изменение содержания различных последовательностей
во вкДНК
1.6.4. Модификация оснований внеклеточной ДНК
1.6.5. Взаимодействие фрагментов внеклеточной ДНК с клетками
1.7. Рецепторы Ти
1.7.1. Природные и синтетические лиганды для белков ТЬЯ9
1.7.2. Ингибиторы взаимодействия Срв-ДИК с ТиТ
1.7.3. Пути передачи сигнала через ТЬК
1.8. Белки нуклеоскелета
1.9. Формулировка задач исследования
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.1.1. Выделение лимфоцитов
2.1.2. Облучение, обработка и инкубирование лимфоцитов для выявления эффекта свидетеля

2.1.3. Ингибирование активности каспазы-
2.1.4. Инкубация клеток с перекисью водорода
2.1.5. Ингибирование окислительного стресса
2.1.6. Приготовление клеточных препаратов
2.2. Цитохимические методы
2.2.1. Нерадиоактивная гибридизация in situ (FISH)
2.2.2. Анализ конформации ядрышка
2.2.3. Анализ изображений
2.3. Определение свойств внеклеточной ДНК
2.3.1. Выделение фрагментов внеклеточной ДНК из среды
инкубации лимфоцитов и их электрофорез
2.3.2. Определение концентрации повторяющихся
последовательностей генома человека в образцах вкДНК
2.3.3. Обработка образцов вкДНК ДНКазой-
2.4. Биохимические методы
2.4.1. Выделение РНК из культивируемых лимфоцитов
2.4.2. Определение концентрации РНК
2.4.3. Определение ферментативной активности каспазы-
2.4.4. Определение нуклеазной активности клеточных лизатов
2.4.5. Определение количества метаболитов окиси азота в среде
2.5. Иммунологический метод
2.5.1. Оценка активности фактора некроза опухоли (TNF-a)
2.6. Ингибирование рецепторов
2.7. Оценка уровня экспрессии генов TLR9 и MyD88 методом ПЦР
в реальном времени
2.8. Определение количества гиподиплоидных клеток
2.9. Статистическая обработка
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Ионизирующее излучение в малых дозах стимулирует апоптоз
лимфоцитов в культуре
2.1.3. Ингибирование активности каспазы-
2.1.4. Инкубация клеток с перекисью водорода
2.1.5. Ингибирование окислительного стресса
2.1.6. Приготовление клеточных препаратов
2.2. Цитохимические методы
2.2.1. Нерадиоактивная гибридизация in situ (FISH)
2.2.2. Анализ конформации ядрышка
2.2.3. Анализ изображений
2.3. Определение свойств внеклеточной ДНК
2.3.1. Выделение фрагментов внеклеточной ДНК из среды инкубации лимфоцитов и их электрофорез
2.3.2. Определение концентрации повторяющихся
последовательностей генома человека в образцах вкДНК
2.3.3. Обработка образцов вкДНК ДНКазой-
2.4. Биохимические методы
2.4.1. Выделение РНК из культивируемых лимфоцитов
2.4.2. Определение концентрации РНК
2.4.3. Определение ферментативной активности каспазы-
2.4.4. Определение нуклеазной активности клеточных лизатов
2.4.5. Определение количества метаболитов окиси азота в среде
2.5. Иммунологический метод
2.5.1. Оценка активности фактора некроза опухоли (TNF-a)
2.6. Ингибирование рецепторов
2.7. Оценка уровня экспрессии генов TLR9 и MyD88 методом ГГЦР
в реальном времени
2.8. Определение количества гиподиплоидных клеток
2.9. Статистическая обработка
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Ионизирующее излучение в малых дозах стимулирует апоптоз
лимфоцитов в культуре

кровотоке человека, о её свойствах и о характере взаимодействия фрагментов вкДНК с клетками.
1.6.1. Происхождение внеклеточной ДНК в организме человека
По вопросу происхождения вкДНК существует несколько гипотез: гибель клеток в результате некроза и апоптоза, самопроизвольный синтез как нормальными, так и трансформированными клетками, а также вследствие гибели бактериальных клеток и вирусов.
В настоящее время основным источником вкДНК в организме человека считаются процессы гибели клеток и деградации их хроматина, происходящие в результате апоптоза. Значительную роль в образовании фрагментов вкДНК из погибших и гибнущих клеток играют макрофаги [Choi et al., 2005], причем показано, что утилизация макрофагами именно апоптотических клеток сопровождается увеличением в циркуляции количества вкДНК. Основным подтверждением этой гипотезы является тот факт, что при электрофорезе низкомолекулярной вкДНК обнаруживаются в среднем четыре фракции возрастающей длины, при этом доминирует содержание фрагментов, соответствующих размеру нуклеосомы (180-200 п.н.), а остальные фрагменты кратны их длине. Из таких субъединиц состоит хроматин ядер, и они могут образовываться под воздействием Ca2+/Mg2! -зависимой эндонуклеазы, активация которой происходит при лучевой и других видах патологии [Collins et al., 1996; Туаева и соавт., 2008]. По второй гипотезе, более ранней, предполагается, что вкДНК образуется в результате синтеза и экскреции фрагментов ДНК лимфоцитами [Rogers, 1976], а также другими типами клеток, в том числе фибробластами [Adams, McIntosh, 1985]. Но в настоящее время, хотя периодически и возобновляются попытки доказательства этой гипотезы [Stroun et al., 2001], большинство исследователей придерживается теории происхождения вкДНК в результате апоптотической гибели клеток.