Ранние изменения транскриптома печени крысы под действием гепатоканцерогенных аминоазосоединений

• Автор: Ершов, Никита Игоревич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ:

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизмы гепатоканцерогенеза. Роль систем регуляции экспрессии генов в становлении опухолевого фенотипа клеток
печени

1.1.1. Комплексные механизмы развития опухолей печени

1.1.2. Изучение механизмов гепатоканцерогенеза с помощью транскриптомного анализа

1.2. Транскрипционные факторы семейства Fox

1.2.1. Структурная организация транскрипционных факторов семейства Fox

1.2.2. Структура сайтов связывания белков семейства Fox на ДНК. Функциональное значение перекрестной сайт-специфичности членов Fox-семейства
1.2.3. Роль транскрипционных факторов FoxO и FoxA в
организме
1.2.4. Роль транскрипционных факторов Fox в
канцер огенезе
1.3. Микросателлитные повторы и их роль в регуляции экспрессии генов
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
2.1. Получение экстрактов ядер клеток печени
2.2. Получение GST-слитого белка, содержащего ДНК-связывающий домен FoxA2 крысы
2.2.1. Выделение геномной ДНК
2.2.2. Получение фрагмента ДНК с использованием

полимеразной цепной реакции
2.2.3. Очистка образцов ДНК с помощью гель-фильтрации на Sephadex G
2.2.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.5. Получение плазмидной конструкции, экспрессирующей слитый с GST фрагмент белка FoxA
2.2.6. Приготовление электрокомпетентных клеток E.coli
2.2.7. Трансформация клеток E.coli
2.2.8. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного
лизиса
2.2.9. Очистка плазмидной ДНК центрифугированием в двуступенчатом градиенте хлористого цезия
2.2.10. Экспресс-очистка образцов ДНК с помощью гель-фильтрации на Sephadex G
2.2.11. Секвенирование ДНК
2.2.12. Наработка и очистка на глутатион-агарозе FoxA2-GST-
слитого белка
2.2.13. Электрофорез белков по методу Лэммли
2.3. Задержка ДНК-зонда в геле
2.3.1. Введение радиоактивной метки в ДНК с помощью фрагмента Клёнова
2.3.2. Торможение ДНК-зонда в геле GST-слитым белком

2.3.3. Торможение ДНК-зонда в геле белками экстрактов ядер
2.4. ПЦР с детекцией в режиме реального времени
2.4.]. Выделение РНК
2.4.2. Получение кДНК
2.4.3. ПНР с детекцией в режиме реального времени
2.5. Гибридизация образцов РНК на микроматрицах и обработка данных микроэррей-анализа
2.6. Распознавание потенциальных сайтов связывания
транскрипционных факторов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Микросателлитные повторы ТТТО как сайты связывания ГохА
и ГохО белков
3.2. Снижение ДНК-связывающей активности ГохОЗ под
действием гепатоканцерогенов
3.3. Изменения транскриптома печени крысы под действием гепатоканцерогенного для этих животных З’-МеДАБ и слабоканцерогенного ОАТ
3.3.1. Функциональный анализ дифференциально
экспрессирующихся генов
3.3.2. Анализ обогащения промоторных районов генов, реагирующих на введение аминоазосоединений,
потенциальными сайтами связывания БохА
3.3.3. Верификация данных микроэррей-анализа по изменению экспрессии генов под действием З'-МеДАБ и ОАТ методом
ПНР в реальном времени
ВЫВОДЫ:
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение А

[Hosaka et al., 2004]. С другой стороны, нокаутные по Fox03 или Fox04 мыши жизнеспособны и практически неотличимы от нормальных животных. У самок Fox03~'~, в отличие от других нокаутов, наблюдается нарушение развития примордиальных яичниковых фолликулов, приводящее к зависимому от возраста бесплодию [Hosaka et al., 2004].
Как уже упоминалось ранее, белки FoxO обладают также и рядом общих для них функций во взрослом организме. Так, совместная экспрессия FoxOl, Fox03 и Fox04 необходима для нормальной экспрессии ферментов глюконеогенеза в печени: у нокаутов по всем трем белкам наблюдается выраженная гипогликемия [Haeusler et al., 2010]. При этом эффективность глюконеогенеза при одновременном нокаутировании FoxOl и FoxA2 неотличима от нуль-мутанта по FoxOl, что указывает на незначительную роль FoxA2 в регуляции этого метаболического пути [Haeusler et al., 2010].
Как FoxA2, так и все белки FoxO опосредуют инсулин-зависимую регуляцию метаболических процессов в печени, непосредственно регулируя экспрессию ряда ключевых ферментов метаболизма и находясь под контролем Akt киназы, фосфорилирующей и инактивирующей эти белки в ответ на стимуляцию инсулином [Hall et al., 2000; Wolfrum et al., 2004; Brunet et al., 2001; Wolfrum et al., 2003]. При этом белки FoxO ответственны преимущественно за индукцию генов, кодирующих ферменты глюконеогенеза, тогда как FoxA2 выступает в роли регулятора метаболизма липидов и желчных кислот [Haeusler et al., 2010; Bochkis et al., 2008; Wolfrum et al., 2004].
В число клеточных функций FoxO также входит индукция ареста клеточного цикла и активация апоптоза, что может быть важным для поддержания дифференцированного состояния клеток, а также в ходе ответа на окислительный стресс [Gilley et al., 2003; Brunet et al., 1999; Modur et al., 2002; Dijkers et al., 2000; Kops et al., 2002; Schmidt et al., 2002; Ramaswamy et al, 2002].