Цитогенетическая характеристика и эпигенетические механизмы формирования хромосомного мозаицизма при нарушении эмбрионального развития человека

• Автор: Кашеварова, Анна Александровна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Томск
• Количество страниц: 174 с.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Хромосомный мозаицизм: частота, распространение, типы, клиническое значение
1.2. Мозаицизм в эмбриогенезе
1.3. Механизмы формирования мозаицизма
1.4. Молекулярные механизмы формирования числовых хромосомных нарушений в соматических клетках
1.5. Эпигенетическая регуляция генома
1.5.1. Эпигенетическое репрограммирование в онтогенезе
1.5.2. Нарушение эпигенетической регуляции генов контроля клеточного цикла и ее связь с патологией
1.6. Методы анализа метилирования ДНК
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
2.1. Материал исследования
2.2. Приготовление препаратов некультивированных клеток цитотро-фобласта хориона
2.3. Приготовление препаратов некультивированных клеток экстра-эмбриональной мезодермы
2.4. Выделение ДНК
2.4.1. Выделение плазмидной ДНК
2.4.2. Выделение ДНК из экстраэмбриональных тканей
2.4.3. Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови
2.5. Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH)
2.5.1. Получение центромероспецифичных ДНК-зондов
2.5.2. Постановка гибридизации

2.5.3. Детекция гибридизационных сигналов
2.5.4. Амплификация гибридизационных сигналов
2.6. Методы анализа метилирования ДНК
2.6.1. Метилспецифичная ПЦР
2.6.2. Обработка ДНК CpG-метилазой
2.6.3. Анализ метилирования ДНК с помощью метилочипа «Infinium HumanMethylation27 BeadChip»
2.7. Статистический анализ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Молекулярно-цитогенетический анализ эмбрионов человека
3.1.1. Определение частоты спонтанной тетраплоидии в нативных экстраэмбриональных тканях
3.1.2. Молекулярно-цитогенетический анализ клеток экстраэмбриональных тканей спонтанных абортусов с диплоидно-тетраплоидным кариотипом, установленным при длительном культивировании in vitro
3.1.3. Молекулярно-цитогенетический анализ экстраэмбриональных тканей спонтанных абортусов с диплоидно-анеуплоидным мозаицизмом
3.2. Изучение статуса метилирования генов контроля клеточного цикла
3.2.1. Оценка статуса метилирования генов контроля клеточного цикла P14ARF, RBI, MAD2, CHFR в плацентарных тканях зародышей человека
3.2.2. Анализ эпигенетического статуса генов регуляции клеточного цикла в плаценте эмбрионов человека с помощью метилочипа «Infinium HumanMethylation27 BeadChip»
3.3. Модель возникновения мозаичных форм геномных мутаций и нарушений эпигенетической регуляции активности генов

3.4. Определение роли эпимутаций генов клеточного цикла в возникновении хромосомного мозаицизма
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ А
ПРИЛОЖЕНИЕ Б
ПРИЛОЖЕНИЕ В

видным регуляторным потенциалом. Недавние исследования на чипах показали, что 3-4 % промоторов гиперметилированы в проанализированных тканях (Weber et al., 2005, 2007; Shen et al., 2007). Зачастую промоторы со сравнительно небольшим количеством CpG оказываются гиперметилиро-ванными (Weber et al., 2007), что согласуется с данными другой работы, в которой было показано, что метилированная фракция, выделенная из крови человека, состояла в основном из ДНК с промежуточным содержанием CpG-островков (Brock et al., 1999).
Следует отметить, что в регуляции транскрипции участвуют не только промоторные CpG-островки, но и богатые CpG-динуклеотидами последовательности, удаленные от сайта начала транскрипции (Edwards, Ferguson-Smith, 2007; Rauch et al., 2009). Так при исследовании 149 CpG-островков длинного плеча хромосомы 21 клеток периферической крови было показано, что только 22 % из них метилированы (Yamada et al., 2004). Также при исследовании всего генома было показано, что 11,6% островков гиперметилированы в проанализированных тканях (Illigworth et al., 2008). Около 25% островков оказались метилированными в В-лимфоцитах человека (Rauch et al., 2009). Полученные данные указывают на то, что метилированные CpG-островки часто локализованы не в промоторах. С этим выводом согласуются результаты бисульфитного секвени-рования, выявившего 2,1% гиперметилированных (> 80 % CpG-динуклеотидов) островков в промоторах по сравнению с более 9 % среди всех исследованных CpG-островков (Eckhardt et al., 2006).
Согласно исследованиям последних лет, метилируются не только CpG-динуклеотиды, но и CpHpG и СрНрН последовательности (где Н - А, Т, С) (Lister, Ecker, 2009). У млекопитающих, по сравнению с растениями, метилирование таких сочетаний нуклеотидов хотя и менее выражено, но составляет значительную долю всего метилирования генома. Функциональная значимость такого сайт-специфичного метилирования практически не изучена. Однако первые работы уже нашли метилирование CpHpG