Молекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийных комаров Anopheles комплекса "Maculipennis"

• Автор: Артемов, Глеб Николаевич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Томск
• Количество страниц: 117 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1 Пространственная организация хромосом в ядре
1.1.1 Модели пространственной организации ядра
1.1.2 Пространственная организация ядра в трофоцитах яичников малярийных комаров
1.1.3 Молекулярные основы внутриядерной организации хроматина 1
1.1.3.1 Взаимодействие хроматина с белками ядерного матрикса 1 б
1.1.3.2 Взаимодействие хроматина с белками ядерной оболочки
1.2 Организация районов прикрепления хромосом к ядерному каркасу
1.2.1 SAR/MAR элементы
1.2.2 Конститутивный гетерохроматин - компартмепт, определяющий пространственную организацию ядра
1.2.3 Эпигенетические особенности формирования гетерохроматина
1.2.3.1 Молекулярно-генетическая организация конститутивного гетерохроматина
1.3 Молекулярная цитогенетика малярийных комаров рода Anopheles
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Приготовление препаратов хромосом
2.2 Микродиссекция исследуемых районов и ПЦР
2.3 Флуоресцентная гибридизация in situ
2.3.1 Введение метки в ДНК-библиотеку
2.3.2 In situ гибридизация
2.4 Получение библиотеки клонов ДНК района 2b-c XL хромосомы An.messeae в плазмиде pJET 1.2/blunt
2.4.1 Лигирование фрагментов ДНК в вектор 5
2.4.2 Трансформация E. coli
2.4.3 Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli
2.5 Определение первичной последовательности ДНК района 2b-c XL

хромосомы Ап. тезяеае
2.6 Анализ последовательности ДНК района 2Ь-с ХЬ хромосомы Ап.
теххеае т яШсо
2.7 Дот- блот гибридизация ДНК проб районов 32с1 Ап. тезхеае и 5а Ап. сйгорагут с библиотекой клонов района 2Ь-с Ап. тезэеае
2.7.1 Приготовление биотинилированных зондов ДНК 326 Ап. теэзеае и 5 а Ап. аРорагуш
2.7.2 Блот-гибридизация
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Исследование локализации последовательностей ДНК, гомологичных последовательностям района 2Ь-с Ап. теххеае на хромосомах малярийных комаров комплекса «тасиИретт»
3.2 Сравнительный анализ районов прикрепления ХЬ хромосомы Ап. теяяеае и 2Ь хромосомы Ап. Ъек1ет15кеу1, а также прицентромерного района 2Б хромосомы Ап. аРорагуш
3.3 Анализ нуклеотидной последовательности ДНК района прикрепления ХЬ хромосомы трофоцитов Ап. теззеае
3.4 Поиск общих последовательностей ДНК в районах прикрепления ХЬ и 311 хромосом Ап. техзеае
3.5 Поиск хромосомоспецифичных последовательностей ДНК в районах прикрепления ХЬ хромосомы Ап. теяяеае и Ап. аРорагуш
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы
Проблема пространственной организации генома возникла в то же время, что и современная генетика, но была незаслуженно забыта в связи с активным развитием представлений о том, что только первичная последовательность ДНК определяет работу генома. В настоящее время, когда просеквенированы геномы многих организмов, стало ясно, что большая часть генома не несет очевидной информационной функции. Считается, что именно некодирующая ДНК, представленная по большей части гетерохроматическими районами, ответственна за укладку остальной части генома (Manuelidis, Borden, 1988; Haaf, Schmid, 1999). Гетерохроматин состоит в основном из двух классов последовательностей - умеренных и тандемных повторов сателлитной ДНК. Как организованы эти повторы в гетерохроматине, каково их значение и посредством каких механизмов осуществляется их функционирование до сих пор остается нерешенной проблемой. Поэтому актуальным является исследование эпигенетических (надгенетических) механизмов функционирования генома, в которых участвует гетерохроматин (Стегний, 2006). Одним из таких механизмов, вероятно, является реорганизация повторов разных классов, которая способна изменять трехмерную ориентацию хромосом в пространстве ядра.
Понимание принципов расположения генетического материала в пространстве ядра (принципов организации хромосомных территорий) имеет особое значение, так как оно во многом определяет его активность, его транскрипционный статус. Следовательно, детальный анализ районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке и становление принципов внутриядерной организации хроматина является актуальной задачей.
Малярийные комары Anopheles комплекса. «maculipennis» являются удобным объектом для изучения вопросов, касающихся надгенетической регуляции работы генома, её механизмов и эволюции. На протяжении многих лет в Томском госуниверситете ведутся работы по изучению
сайленсинга» не действует. У дрозофилы более 50 Su(var). В начале процесса формирования гетерохроматина происходит деацетилирование гистона НЗ-К9 деацетилазами (HDAC 1, histone deacetilase 1), которое сопровождается его метилированием с помощью фермента SU(VAR)3-9 (Czermin et al. 2001) -гистоновой метилтрансферазы. Она метилирует аминогруппу лизина, находящуюся в радикале этой аминокислоты (s-аминогруппа) и способную принимать от одной до трех метильных групп (Rice and Allis, 2001; Zhang et al., 2003). Степень метилирования гистона НЗ определяет уровень транскрипционной активности хроматина. Так, триметилированный НЗ находят в прицентромерном гетерохроматине мышей. Таким образом, в конститутивном гетерохроматине НЗ триметилирован и такое состояние хроматина считается необратимым. В факультативном гетерохроматине гистоны НЗ моно- и диметилированы (Rice et al., 2003). Метилированный НЗ-К9 узнает НР1. НР1 — небольшой белок (у дрозофилы 206 аминокислот) с двумя консервативными доменами. N-концевой участок НР1 - хромодомен -отвечает за контакт с метилированным НЗ-К9, С-концевой домен (chromoshadow) имеет сродство с SU(VAR)3-9. Метилированный НЗ-К9 связывает НР1, который в свою очередь привлекает новую молекулу фермента. SU(VAR)3-9 совершает акт метилирования на соседней нуклеосоме. Таким образом, запускается каскад реакций, приводящих к распространению неактивного состояния хроматина вдоль фибриллы (Talbert and Henikoff, 2006).
Известно, что НР1, который задействован в механизме генетического сайленсинга, является одним из ключевых белков, обеспечивающих взаимодействие гетерохроматина с белками ядерной оболочки (Wang et al., 2004). Кроме НР1 эту функцию способен выполнять другой белок хроматина - SUUR, который по структуре подобен ламину В (Pindyurin et al., 2007).
Из описанного следует, что не только последовательность ДНК гетерохроматина, но и характерные для него белки способны