Молекулярно-генетическая характеристика индивидуального района интеркалярного гетерохроматина 75C1-2 политенных хромосом дрозофилы

• Автор: Андреенкова, Наталья Григорьевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 147 с. : ил.

Оглавление
Введение
Список основных используемых сокращений
1. Особенности организации и функционирования генома в районах интеркалярного и прицентромерного гетерохроматина (обзор литературы)
1.1. Введение
1.2. Молекулярная организация молчащих районов
1.2.1. Нуклеосомная организация и модификации гистонов в молчащих районах хромосом
1.2.2. Белковые комплексы, обеспечивающие структуру молчащих районов
1.2.2.1. Белки группы Ро1усотЬ
1.2.2.2. НЩегосйгошабп Рго1е1п1 (НР1)
1.2.2.3. РНК-интерференция как механизм регуляции активности генов
1.2.2.4. Метилирование цитозина
1.2.2.5. Другие системы образования репрессированной структуры хроматина
1.3. Характеристики молчащих районов хроматина
1.3.1. Плотная упаковка хроматина
1.3.2. Поздняя репликация
1.3.2.1. Педорепликация ГХ в нолитенных хромосомах
1.3.2.2. Двуцепочечные разрывы ДНК
1.3.2.3. Эктопические контакты в политенных хромосомах
1.3.3. Генетическое содержание и транскрипционная активность районов ГХ
1.3.4. Распространение репрессированного состояния хроматина вдоль по хромосомам
1.3.4.1. Ограничения для распространения репрессированного состояния хроматина
1.3.4.2. Эффект положения
1.3.5 Наследование статуса хроматина в ряду клеточных поколений
1.3.5.1. Появление молчащих районов в эмбриогенезе
1.3.5.2. Наследование статуса хроматина в процессе репликации ДНК
1.3.5.3. Обратимость сайленсинга
1.4. Доменная организация хроматина
1.4.1. Кластеризация генов
1.4.2. Транскрипционная активность и время репликации
1.4.3. Расположение хроматина в ядре
1.4.4. Другие механизмы образования доменов

1.4.5. Различия доменной организации в разных тканях организма
1.4.6. Самоорганизация ядерного пространства в эволюции
1.5. Влияние белка SUUR на проявление свойств гетерохроматина
1.5.1. Белок Suppressor of Underreplication
1.5.2. Локализация SUUR на хромосомах
1.5.3. Эктопическая экспрессия SUUR
1.5.4. B3aHM0fleiicTBiin.SUUR с белками ГХ
1.5.5. Возможные механизмы действия белка SUUR
1.6. Разнообразие ГХ
1.7. Заключение и постановка задач исследования
2. Материалы и методы
2.1. Генетические методы
2.1.1. Генетические линии дрозофилы и их ведение
2.1.2. Введение двух дополнительных доз гена SuUR в линии с перестройками
2.2. Цитологические методы
2.2.1. Изготовление давленых препаратов полптенных хромосом слюнных желез для световой микроскопии
2.2.2. Анализ препаратов политенных хромосом
2.2.3. Анализ частоты появления разломов в районе 75С
2.2.4. Индукция образования «пузырей» в районах ИГХ политенных хромосом .
2.2.5. Изготовление препаратов для гибридизации in situ
2.2.6. Мечение ДНК-зондов для Саузерн-блот гибридизации и гибридизации in situ
2.2.7. Флюоресцентная ДНК/ДНК in situ гибридизация (FISFI) на политенных хромосомах
2.2.8. Изготовление препаратов для иммуноокрашивания политенных хромосом
2.2.9. Иммуноокрашивание политенных хромосом
2.3. Молекулярно-генетические методы
2.3.1. Амплификация и последующее клонирование последовательностей ДНК.
2.3.2. Выделение геномной ДНК из целых мух для ПЦР
2.3.3. Элюция ДНК из агарозного геля
2.3.4. Достраивание укороченных 5’-концов дву цепочечной ДНК
2.3.5. Трансформация клеток A. coli плазмидной ДНК (электропорация)
2.3.6. Наработка и выделение плазмидной ДНК в E. coli
2.4. Определение степени политенизации ДНК
2.4.1. Заливка ядер или клеток в агарозные блочки

2.4.2. Определение степени политенизации с помощью Саузерн-блот гибридизации
3. Результаты
3.1. Характеристика района 75С
3.2. Получение хромосомных перестроек методом FLP-FRT-рекомбинации
3.3. Картирование района 75С на физической карте хромосомного плеча 3L
3.4. Функциональная диссекция района 75С
3.4.1. Анализ частоты разломов в разных частях района 75С
3.4.2. Определение профиля политенизации ДНК врайоне 75С
3.4.3. Недореплицированные молекулы ДНК в районе 75С
3.4.4. Локализация белка SUUR и формирование «пузырей» в районе 75С1-2
3.4.5. Зависимость степени политенизации от окружающих последовательностей
3.4.6. Выявление свободных концов нитей ДНК в районе 75С
4. Обсуждение
4.1. Недорепликация ДНК в районе 75С
4.2. Влияние белка SUUR на структуру хроматина в районе 75С
4.3. Генетическое содержание района 75С
4.4. Типы районов ИГХ
Выводы
Список литературы

нормальной работы, клетки, (о разных вариантах возникновения ГХ-генов можно прочитать у Yasuhara J.C. and Wakimoto В.Т., 2006).
ИГХ заметно отличается по своей первичной последовательности от ПГХ и ТГХ. Для, ИГХ не показано такой;обогащенности повторами, для, него характерны, bs основном, уникальные молчащие гены и транспозоны (по обзору: Zhimulev I.F. et al., 2003а). Как уже говорилось, эти относительно немногочисленные гены, в большинстве тканей транскрипционно неактивны, то есть находятся' в состоянии сайленсинга. Кроме того, для ИГХ характерны кластеры, состоящие из тандемных повторов высокогомологичных генов: в районе 39Е локализован кластер гистоновых генов, а в районе 56F1-7 - гены. 5S рибосомалытой РНК. Все эти локусы недореплицпруются' в политенных хромосомах слюнных желез. При этом активна только часть генов из перечисленных кластеров, как это наблюдается для генов 28S и 18S рибосомальных РНК в районе ядрышкового организатора (по Жимулев И.Ф. и др., 2000).
Методом гибридизации' на микрочипах было показано, что 8,6% из 10600 предсказанных генов дрозофилы находятся в участках недорепликации, то есть локализуются в ИГХ (Belyakin S.N. et al., 2005): Кроме того, оказалось, что районы ИГХ у дрозофилы, как и ПГХ, обогащены относительно соседних районов, очень длинными, но к тому же и очень короткими генами с большими промежутками между ними (Belyakin S.N. et al., 2010; Бабенко B.H. и др., 2009). При этом гены в ИГХ имеют, в общем, гораздо более тканеспецифичный паттерн экспрессии, чем гены в ЭХ. Значительная часть коротких генов оказалась тестис-специфичными (Belyakin
S.N. et al., 2010).
Интересно, что длинные гены с большими интронами, где бы они не находились, демонстрируют очень тканеспецифичную экспрессию (Belyakin S.N. et al., 2010). Возможно, в длинных нитронах находятся регуляторные элементы, обеспечивающие тканеспецифичную экспрессию этих генов, а для ГХ-генов - так же и нормальную работу в гетерохроматиновом окружении. Однако, и в ИГХ, и в ПГХ существуют и очень короткие гены, которые также способны экспрессироваться и в ГХ, и тканеспецифично (Schulze S.R. et al., 2006; Belyakin S.N. et al., 2010). Возможно, регуляция таких генов осуществляется на уровне больших хроматиновых доменов. Для этого могут служить какие-либо цис-элементы, расположенные в длинных межгенных промежутках ГХ. Любопытно, что гены-мишени Su(var)3-9 и НР1 в прицентромерных районах преимущественно специфичны для эмбрионов, а на плечах хромосом Su(var)3-9 связывается, в основном, с генами, специфичными для самцов (Greil F. et al., 2003).