Выявление связанных с регуляцией пролиферации генов-мишеней транскрипционных факторов FoxA в геноме мыши

• Автор: Брызгалов, Леонид Олегович
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 129 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Участие тканеспецифичных транскрипционных факторов в регуляции процессов пролиферации и апоптоза

1. Транскрипционные факторы MyoD и MRF

2. Транскрипционный фактор С/ЕВРа

II. Семейство транскрипционных факторов winged helix (FOX белки)

1. Номенклатура FOX белков

2. Участие транскрипционных факторов семейства winged helix

в процессах пролиферации и апоптоза

2а. Пропролиферативные свойства FOX белков
26. Антипролиферативные свойства FOX белков
III. Подсемейство FoxA
1. Структура транскрипционных факторов FoxA
2. Структура сайтов связывания FoxA белков на ДНК
3. Факторы, влияющие на активность FoxA белков
3. Роль подсемейства FoxA в эмбриогенезе
4. Участие FoxA белков в органогенезе
4а. Развитие печени
46. Развитие поджелудочной э/селезы
4в. Развитие легких
4г. Развитие простаты
5. Роль FoxA во взрослом организме
6. Связь FoxA белков с гепатоканцерогенезом
7. Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
Методы
I. Получение экстрактов ядер клеток печени
II. Получение GST-слитых белков, содержащих ДНК-связывающий домен FoxA2 крысы и ДНК-связывающий домен FoxA3 мыши
1. Выделение геномной ДНК
2. Получение фрагментов ДНК с использованием полимеразной цепной реакции
3. Очистка образцов ДНК с помощью гель-фильтрации на Sephadex Gl
4. Электрофорез ДНК в агарозном геле
5. Получение плазмидных конструкций, экспрессирующих слитые с GST фрагменты белков FoxA2 и FoxA
6. Приготовление электрокомпетентных клеток E. coli
7. Трансформация клеток E.coli
8. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
9. Очистка плазмидной ДНК центрифугированием в двуступенчатом градиенте хлористого цезия
10. Экспресс-очистка образцов ДНК с помощью гелъ-филыпрации на Sephadex G
11. Секвенирование ДНК
12. Наработка и очистка на глутатион-агарозе GST-слитых белков FoxA2 и FoxA
13. Электрофорез белков по методу Лэмли
III. Задержка ДНК-зонда в геле
1. Введение радиоактивной метки в ДНК с помощью фрагмента Клёнова
2. Торможение ДНК-зонда в геле GST-слитыми белками
3. Торможение ДНК-зонда в геле белками экстрактов ядер
IV. Гибридизация со специфическими антителами

V. ПЦР в реальном времени
1. Выделение РНК
2. Получение кДНК
3. ПЦР в реальном времени
VI. Иммунопреципитация хроматина
1. Иммунопреципитация хроматина
2. Выявление фрагментов ДНК содержащих сайты связывания
FoxAl и FoxA2 с помощью ПЦР
VII. Компьютерный анализ и обработка данных
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
I. Изучение влияния ДЭНА и 4’-МеДАБ на FoxA ДНК-связывающую
активность в печени мышей
II. Влияние ОАТ и 3'-МеДАБ на ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов FoxA у мышей линии ICR разного возраста
III. Влияние ОАТ на связывание FoxA с регуляторными районами гена TAT in vivo
IV. Поиск потенциальных генов-мишеней FoxA, связанных с регуляцией клеточного цикла и апоптоза, с использованием данных массового анализа экспрессии генов
V. Поиск потенциальных сайтов связывания FoxA белков, и их возможных генов-мишеней с помощью метода SITECON.
VI. Экспериментальная проверка предсказанных сайтов связывания FoxA белков
VII. Влияние ОАТ на экспрессию потенциальных генов-мишеней FoxA
VIII. Исследование участия FoxA белков в регуляции гена Cul2 in vivo
IX. Обсуждение
X. Заключение

Показано взаимодействие FoxA2 с серин-треонин киназой PKB/Akt [Wolfrum, et al., 2003]; Последняя фосфорилирует FoxA2 по треонину-156, что, в свою очередь, приводит к удалению этого 'транскрипционного фактора из ядра и, соответственно, к снижению экспрессии его генов-мишеней. Был установлен сайт фосфорилирования ■ FoxA2 (R152RSYTH157), отсутствующий у белков FoxAl и Fox A3. Таким образом стал известен механизм инсулин-опосредованной репрессии транскрипции генов, контролируемых этим белком. При; этом предпологается, что инсулиновой регуляции подвержен только фактор FoxA2, в то время как FoxAl и FoxA3 обеспечивают базальную регуляцию транскрипции FoxA-регулируемых генов [Wolfrum, et al., 2003].
3i Роль подсемейства FoxA в эмбриогенезе.
Мыши,; гомозиготные; по мутации, ведущей к полному нарушению функции FoxA2 белка, умирают на 11 день эмбрионального развития. У них обнаруживаются сильные дефекты структуры всех трех зародышевых листков, неправильное развитие нервной, трубки, сомитов, отсутствие нотохорда и остановка развития пищеварительной трубки, при этом в ней все же обнаруживаются клетки эндодермы [Weinstein et al., 1994]. Некоторые дефекты, такие как нарушения развития: нервной трубки и нотохорда, как. было показано, могут быть связаны с отсутствием экспрессии морфогена Sonic hedgehog (Shh) [Filosa et al., 1997; Epstein et al., 1999], так как FoxA2 совместно с транскрипционным фактором Goosecoid (Gsc) участвует в; его активации [Filosa et al., 1997]. Подавление, экспрессии FoxA2 на более поздних этапах развития приводит к нарушению развития только тех органов, которые являются производными энтодермы [Weinstein et al., 1994]. В отличие от FoxA2, отсутствие FoxAl и FoxA3 не ведет к гибели на ранних этапах развития. Как FoxAl-/-, так и FoxA3-/-мыши после рождения имеют нормальный фенотип, однако у мышей нокаутных по FoxAl снижен синтез глюкагона в поджелудочной железе и они умирают вскоре после