Изменения транскриптома сетчатки крыс OXYS с возрастом при развитии ретинопатии

• Автор: Кожевникова, Оюна Суранзановна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 156 с. : ил.

2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 1 Возрастная макулярная дегенерация (ВМД)

111 Возрастные изменения сетчатки

112 Патогенез ВМД

113 Генетические факторы ВМД

1 2 Исследования транскриптома сетчатки

1 3 Модели ВМД

13 1 Геномодифицированные модепи ВМД

13 2 «Естественные» и одет ВМД

1 4 Функциональные и морфологические особенности крыс линии OXYS
14 1 Крысы OXYS- модезь ВМД
1 5 Молекулярно-генетические методы выявления генов, участвующих в генетическом
контроле и патогенезе комплексных заболеваний
151 Картирование генов комппексных забозеваний
15 2 Методы опредезения транскрипционных профипей
115 1 ДНК-микрочипы
115 2 Массовое параиеппьное секвенирование (RNA-seq)
Заключение
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2 1 Материалы, использованные в работе
2 2 Животные
2 3 Офтальмологические осмотры
2 4 Забор и хранение образцов
2 5 Световая микроскопия
2 6 Анализ ДНК-микрочипов
2 6 1 Выбор опигонукзеотидных зондов
2 6 2 Изготовзение ДНК-микрочипов
2 6 3 Гибридизация
2 6 4 Обработка данных
2 7 Массовое параллельное секвенирование (RNA-seq)
2 71 Секвенирование на пзатформе Illumina
2 7 2 Картирование и аназиз дифференциапьной экспрессии

2.8. Выделение РНК
2.9. Обратная транскрипция
2.10. Полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ)
2.10.1. Праймеры для ПЦР-РВ
2.11. Выделение белка
2.12. Содержание амилоидного пептида А(342 в сетчатке крыс
2.13. Содержание белка Cryab в сетчатке крыс
2.14. Иммунофлуоресцентная микроскопия
2.14.1. Приготовление препаратов
2.14.2. Анализ и обработка изображений
2.15. Статистический анализ
ГЛАВА 3: РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Анализ заболеваемости конгснных линий WAG/OXYS-1.1, WAG/OXYS-1.2 ретинопатией
3.2. Функциональная аннотация локусов QTL, ассоциированных с развитием признаков
преждевременного старения у крыс OXYS
3.3. Отбор генов-кандидатов на целевой ДНК-микрочип
3.4. Определение статуса экспрессии генов-кандидатов методом анализа ДНК-микрочипов
3.5. Анализ данных RNA-seq
3.6. Функциональная аннотация дифференциально экспрессирующихся генов
3.7. Накопление амилоидного пептида Ар в сетчатке крыс OXYS
ГЛАВА 4: ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение
Приложение
Приложение

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АФК - активные формы кислорода
БСА - бычий сывороточный альбумин
БХ - поправка Бенжамини-Хохберга
вмд - возрастная макулярная дегенерация
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДЭ - дифференциально экспрессирующиеся (гены)
ИФА - иммуноферментный анализ
кДНК - комплементарная ДНК
мРНК - матричная мРНК
МРТ - магниторезонансная томография
и.о. - нуклеотидные основания
ПГАА - полногеномный анализ ассоциаций
ПОЛ - продукты перекисного окисления липидов
п.н. - пар нуклеотидов
ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени
РНК - рибонуклеиновая кислота
РПЭ - ретинальный пигментный эпителий
Трис - трис(гидроксиметил)аминометан
ХНВ - хориоретинальная неоваскуляризация
цнс - центральная нервная система
ЭДТА - этилендиаминтетрауксуная кислота
А2Е - бис-ретиналиден-этаноламин
Ар - амилоидный пептид
CDCV - гипотеза «распространенная болезнь - распространенный генетический вариант» (Common Disease - Common Variant hypothesis)
CDRV - гипотеза «распространенная болезнь - множественные редкие генетические варианты» (Common Disease - Multiple Rare Variants hypothesis)
FDR - false discovery rate
FKPM - fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments
RNA-seq - метод массового паралелльного секвенирования
KEGG - Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
QTL - локус количественного признака
SDS - лаурилсульфат натрия

гемовых цитохромов. В этой же работе было показано, что источником АФК у крыс OXYS могут быть гранулоциты крови (Меньшикова и др. 2000).
Важно, что первые признаки преждевременного старения у крыс OXYS начинают проявляться в возрасте 2-3 месяцев, в период, когда у крыс завершается половое созревание и начинается инволюция тимуса. Поэтому преждевременное иммуностарение может рассматриваться как основная причина развития характерных для крыс OXYS признаков. Тимус - это центральный орган иммунной системы, ответственный за клеточный иммунитет. Инволюция тимуса является главным возрастным изменением иммунной системы: по состоянию и функциональной активности этого органа можно определить биологический возраст животных и человека (Aspinall et al. 2008). Как показали гравиметрические и морфометрические исследования, массовый индекс тимуса, общий объем тимуса, объем коркового, мозгового вещества и соединительнотканой стромы у крыс OXYS в возрасте 3 месяцев значительно ниже, чем у крыс Вистар. Микроскопическое исследование срезов тимуса крыс OXYS выявило уменьшение плотности расположения лимфоидных клеток в корковом и мозговом веществе, а также сниженное, по сравнению с крысами Вистар, количество бластов в субкапсулярной зоне коркового вещества (Маркова и др. 2003). В дальнейшем было показано, что гипоплазия тимуса крыс OXYS является врожденной и приводит к более низким пиковым показателям массы, размеров и клеточности, а также дисбалансу субпопуляций Т-лимфоцитов (Obukhova et al. 2009, Обухова и др. 2013). В результате таких изменений происходит снижение активности Т-клеточного звена иммунной системы, что, в частности, проявляется как подавление реакции гиперчувствительности замедленного типа, которая у крыс OXYS в 2,4 раза ниже, чем у крыс Вистар (Маркова и др. 2003). Дисрегуляция гемопоэза может являться причиной нарушения функций иммунной системы в старости. Интересно, что у крыс OXYS было обнаружено увеличение количества гранулоцитарно-макрофагальных
предшественников в костном мозге по сравнению с крысами Вистар начиная с возраста 3 месяцев, ранних эритроидных предшественников - начиная с 12 месяцев (Орловская и др. 2007).
Становление мозга крыс OXYS происходит на фоне задержки формирования микроциркуляторного русла в ранний постнатальный период, на что указывает снижение в 1,5 раза по сравнению с крысами Вистар митотической активности