Феномен избирательной окраски флуорохромом акридиновым оранжевым гетерохроматиновых районов метафазных хромосом человека

• Автор: Трофимова, Ирина Леонидовна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Конститутивный (прицентромерный) гетерохроматин
1.2. Структурно - функциональная роль прицентромерного гетерохроматина
1.2.1. Структурные функции прицентромерного гетерохроматина
1.2.2. Степень конденсации прицентромерного гетерохроматина в ядре
1.2.3. Функциональная роль прицентромерного гетерохроматина
1.2.3.1. Гены в составе прицентромерного гетерохроматина
1.2.3.2.Эпигенетические модификации прицентромерного гетерохроматина: метилирование ДНК и модификации гистонов
1.2.3.3. Взаимодействие негистонового белка НР1 с прицентромерным гетерохроматином
1.2.3.4. Особенности репликации прицентромерного гетерохроматина в
клеточном цикле
1.2.3.5. Транскрипционная активность ДНК прицентромерного гетерохроматина
1.3. Вклад прицентромерного гетерохроматина в топологию интерфазного ядра
1.4. Гипотеза Главной Программы Развития
1.5. Особенности прицентромерного гетерохроматина в эмбриональных и экстраэмбриональных клетках человека
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
2.1 Материал исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Методика приготовления препаратов метафазных хромосом из клеток хориона (плаценты) и эмбриональных органов человека
2.2.2. Методика приготовления препаратов метафазных хромосом из хориона (плаценты) и эмбриональных тканей без мацерации в уксусной кислоте
2.2.3. Приготовление препаратов метафазных хромосом из ворсин хориона и эмбриональных органов человека «полупрямым» методом
2.2.4. Методика приготовления препаратов митотических хромосом из лимфоцитов периферической и пуповинной крови человека
2.2.5. Методика приготовления препаратов интерфазных ядер для 3 D FISH анализа

2.2.6. Методика приготовления препаратов хромосом из костного мозга и семенников мыши
2.2.7. Препараты хромосом из других тканей
2.2.8. Хранение препаратов
2.3. Методы дифференциальной окраски препаратов метафазных хромосом
2.3.1. QFH окрашивание препаратов метафазных хромосом
2.3.2. Окрашивание препаратов метафазных хромосом акридиновым оранжевым
2.3.3.Окрашивание препаратов метафазных хромосом акридиновым оранжевым, приготовленным на буфере с кислым pH
2.4. Обработки препаратов эндонуклеазами in situ
2.4.1. Обработки препаратов метафазных хромосом РНКазой-А и РНКазой-Н
2.4.2. Обработки препаратов метафазных хромосом ДНКазой
2.4.3. Обработки препаратов метафазных хромосом лигазой Т4
2.4.4. Последовательные обработки препаратов метафазных хромосом РНКазой- А и
ДНКазой
2.5. Обработки препаратов протеолитическими ферментами
2.5.1. Обработки препаратов метафазных хромосом протеиназой К
2.5.2. Обработки препаратов метафазных хромосом пепсином
2.5.3. Обработки препаратов метафазных хромосом трипсином
2.5.4. Контрольные эксперименты

2.2.6.1. Метод «меченных» митозов
2.2.6.2. Иммуноцитохимическое определение сегментов хромосом, включивших БДУ
2.7. Определение митотического индекса
2.8. 2-D FISH анализ
2.9. 3-D FISH анализ
2.9. Анализ препаратов
2.9.1. Люминисцентная микроскопия
2.9.2. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
2.10. Измерение расстояний 3D изображений
2.10.1. Измерение расстояний между HS3-1 и ядерной периферией
2.10.2. Ассоциация HS3-1 с хромоцентром

2.10. 3. Коррекция расстояний
2.11. Выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР
2.12. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Анализ репликации гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9, 16 в нескольких клеточных циклах при физиологической беременности и при остановке развития плода
3.2. Особенности митотической активности клеток цитотрофобласта хориона при физиологической беременности и при остановке развития плода
3.3. Характер окрашивания акридиновым оранжевым гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9, 16 при различных условиях приготовления и флуорохромирования препаратов
3.4. Анализ окраски прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9 и 16 флуорохромом акридиновым оранжевым после различных цитохимических предобработок
3.6. Локализация НБЗ-1 в интерфазных ядрах клеток эмбриона, хориона и плаценты
3.7. Анализ транскрипционной активности НБЗ
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Особенности митотической активности клеток хориона и репликации
прицентромерного гетерохроматина хромосом 1,9, 16 в клетках хориона
4.2. Тканеспецифичные особенности окраски флуорохромом акридиновым оранжевым районов прицентромерного гетерохроматина хромосом
4.3. Цитохимические особенности районов прицентромерного гетерохроматина
метафазных хромосом из клеток цитотрофобласта хориона и эмбриональных органов, выявляемые с помощью флуорохрома акридинового оранжевого
4.4. Локализация и транскрипционная активность Я55-7 в эмбриональных и
экстраэмбриональных тканях
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

2.2.4. Методика приготовления препаратов митотических хромосом из лимфоцитов периферической и пуповинной крови человека.
Препараты метафазных хромосом готовили по стандартной методике (Кузнецова и др., 1999).
1) В пенициллиновые флаконы добавляли: 4,5 мл среды (RPMI 1640) (Биолот), антибиотик (гентамицин 100мкг/мл), глутамин (0,2 мкг/мл) (Serva), 0,5 мл бычьей эмбриональной сыворотки (Биолот), 0,2 мл ФГА (либо 150 мкл LF-7, Biomed) добавляли из шприца 4-6 капель (0,2 - 0,3 мл) цельной гепаринизированной венозной крови. Стандартное время культивирования - 72 часа при +37°С в закрытой системе.
2) На 72-м часу культивирования за 45 мин до начала фиксации, в культуру вводили колхицин в конечной концентрации 8,0 мкг/мл.
3) По окончании культивирования содержимое флаконов переносили в центрифужные пробирки, клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин 10 мин, супернатант удаляли пипеткой, оставляя 0,3-0,5 мл над осадком. Осадок разбивали энергичным встряхиванием и добавляли 5 мл гипотонического раствора (0,55% КС1), перемешивали пипетированием и инкубировали 15-20 мин при 37°С.
4) По окончании игпотонической обработки в пробирки добавляли 0,5 мл свежеприготовленного фиксатора (этанол + ледяная уксусная кислота, в соотношении 3:1) и перемешивали пипетированием. Пробирки центрифугировали (10 мин, 1000 об/мин), супернатант осторожно удаляли пипеткой, осадок разбивали встряхиванием.
5) К осадку струйно приливали 5 мл холодного фиксатора и перемешивали пипетированием. Первую фиксацию проводили при +4°С в течение 30 мин. Пробирки центрифугировали (10 мин, 1000 об/мин), супернатант осторожно удаляли пипеткой, осадок разбивали встряхиванием. Затем фиксатор меняли 3 раза, добавляя порции по 5-7 мл. Время каждой фиксации - 15-20 мин при +4°С.
6) Раскапывание суспензии проводили на предметные стекла, охлажденные в морозильной камере или в холодной воде, нанося на препарат с высоты 30-50 см по 30-50 мкл суспензии. Препараты высушивали при комнатной температуре.
2.2.5. Методика приготовления препаратов интерфазных ядер для 3 D F1SH анализа.
Препараты интерфазных ядер для 3 D FISH анализа готовили согласно протоколу (Вайссертрейгер и др., 2007) с небольшими модификациями.