Оптимизация методов криоконсервации спермы для сохранения генофонда осетровых рыб

• Автор: Богатырева, Мария Михайловна
• Шифр специальности: 03.02.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Астрахань
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1Л. Применение методов криобиологии для сохранения
биоразнообразия
1.2. Общие принципы криоконсервации генетического 12 материала рыб
1.3. Криоконсервация спермы лососевых рыб
1.4. Криоконсервация спермы карповых рыб
1.5. Криоконсервация спермы осетровых рыб
1.6. Криоконсервация спермы перспективных объектов аквакультуры 44 ГЛАВА И. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА III. ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА КРИОПРОТЕКТОРА 56 ДЛЯ СПЕРМЫ ОСЕТРОВЫХ РЫБ
3.1. Использование криопротекторов для краткосрочного 58 хранения спермы
3.2. Подбор криопротекторов для глубокого замораживания 63 половых клеток в жидком азоте
ГЛАВА IV. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОЦЕССА 74 КРИОКОНСЕРВАЦИИ РЕПРОДУКТИВНЫХ КЛЕТОК ОСЕТРОВЫХ РЫБ
4.1. Исследование метода электростимуляции половых клеток 74 осетровых рыб
4.2. Выведение протектора из клеток после криоконсервации 82 спермы осетровых рыб
4.3. Определение оптимальных параметров усовершенствованной 85 схемы криоконсервации половых клеток осетровых рыб
ГЛАВА V. РЕЗУЛЬТАТЫ ОСЕМЕНЕНИЯ ЯЙЦЕКЛЕТОК
ОСЕТРОВЫХ РЫБ ДЕФРОСТИРОВАННОЙ СПЕРМОЙ
5.1. Оплодотворение икры дефростированной спермой в

лабораторных условиях
5.2. Оплодотворение икры дефростированной спермой в 89 условиях рыбоводного завода
5.3. Поведенческие реакции молоди русского осетра, полученной с 95 помощью нативной и криоконсервированной спермы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Антропогенное влияние на гидрологические условия и трофику рыб привело не только к снижению численности ценных видов пресноводных, солоноводных, проходных и морских рыб, но и к исчезновению отдельных видов. Обеднение генофонда происходит и в результате селекционных мероприятий, предполагающих отбор для разведения лишь части наиболее продуктивных рыб.
В последние годы в экосистемах водоемов наблюдаются существенные изменения, в результате которых произошло снижение численности осетровых рыб. В связи с этим основным источником формирования и поддержания запасов осетровых стало их искусственное воспроизводство. Однако в настоящее время отмечается снижение масштабов заводского воспроизводства. Одной из причин этого является отсутствие возможности заготовки производителей с высокими рыбоводно-продуктивными показателями.
Возникла необходимость разработки разнообразных подходов использования и сохранения популяционного генофонда производителей естественной генерации для целей искусственного воспроизводства.
Криоконсервация остается одним из наиболее привлекательных и быстроразвивающихся направлений сохранения редких исчезающих видов. Наличие в криобанке генетически репрезентативных коллекций геномов рыб и маточных стад на осетровых рыбоводных заводах позволяет с максимальным эффектом сохранить генетическое разнообразие этих ценных промысловых объектов.
В настоящее время разработаны методики криоконсервации половых продуктов рыб, в частности осетровых (Копейка, 1986; Цветкова и др., 1997; ЫпЬаЛ еЦ 2009). Однако результаты часто невоспроизводимы и не всегда обеспечивают высокий процент выживаемости дефростированных сперматозоидов. Это связано с тем, что на процесс криоконсервации

1.4. Криоконсервация спермы карповых рыб
Криоконсервированная сперма может найти широкое применение в селекционно-племенной работе с различными культивируемыми видами рыб - объектами аквакультуры. В первую очередь это относится к сохранению генофонда отечественных и импортируемых породных групп карпа. При этом появляется возможность избежать инбредной депрессии, упрощается получение промышленных гибридов, перевозка генетического материала и т.д.
Исходя из важного практического значения и перспективы криоконсервации в рыбоводстве специалистами Института рыбного хозяйства Украины и Института разведения и генетики животных с мая 2001 г. начато формирование экспериментального криобанка генетических ресурсов украинских пород карпа. В качестве криопротекторов применяли как этиленгликоль, диметилсульфоксид, метанол, так и ряд модификаций.
Криоконсервирование проводили в форме открытых гранул объемом 0,2 мл на охлажденной фторопластовой пластинке в 2 этапа: от 0 до -130°С гранулы замораживали со скоростью 145°С/мин.; гранулы, охлажденные до -130°С, опускали в жидкий азот. Замороженные гранулы размораживали с использованием водяной бани при 40°С в течение 30 с. Размороженную сперму активировали прудовой водой, а также 2,5-2,7% цитратным буфером. Последний оказался более эффективным, его использование позволяло увеличить продолжительность поступательного движения сперматозоидов в
1,5 раза. По результатам работ 2001-2003 гг. заморожено и заложено на хранение в криобанке 775 спермадоз элитных производителей карпа нивчанского внутрипородного типа украинской чешуйчатой породы, а также малочешуйчатого карпа второго селекционного поколения (Ананьев и др., 1998 б).
Подвижность оттаянных спермиев карповых рыб варьирует в широких пределах - 20-80% (Chen Song Lin et al., 1992; Lubzens et al., 1993). Для