Филогения и механизмы формирования ареалов хариусов бассейна реки Амур : род Thymallus, Salmonidae

• Автор: Семенченко, Александр Анатольевич
• Шифр специальности: 03.02.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 150 с. : ил.

Оглавление
Введение

Глава 1. Обзор литературы по проблеме исследования

1.1. Краткая история изучения хариусов Амурского бассейна

1.2. Филогения и гипотезы происхождения хариусовых рыб

Глава 2. Материалы и методы

Глава 3. Генетическая изменчивость и внутривидовая структура

амурских хариусов

3.1. Генетическая изменчивость

3.2. Внутривидовая структура амурских хариусов

3.2.1. Нижнеамурский хариус (ТкутаИш Пщагтаё)

3.2.2. Желтопятнистый хариус (Т. grubiiАауотасиШт)
3.2.3. Верхнеамурский хариус (Г. grubii ^гиЫг)
Глава 4. Филогенетические связи видов и форм хариусов
4.1. Филогения амурских хариусов и других представителей рода
4.2. Происхождение и основные этапы формирования ареалов амурских хариусов
4.3. Вопросы таксономического статуса амурских хариусов
Глава 5. Калибровка и применение молекулярных часов для хариусов
р. Амур
Выводы
Список сокращений
Список литературы
Приложения
Введение
Актуальность работы. Хариусы юга Дальнего Востока России являются ценнейшими объектами любительского рыболовства, а также модельной группой рыб для изучения пресноводной биогеографии. Долгое время считалось, что на территории Амура обитает лишь один вид хариуса - амурский хариус (Thymallus grubei Dybowski, 1869). Позже многие авторы отмечали значительную неоднородность различных популяций этого вида [Книжин и др., 2004), что впоследствии дало предпосылки для пересмотра таксономического статуса хариусов Амура [Антонов, 2004; Книжин и др., 2006, 2007 и др.]. Авторами были выделены 4 формы хариусов: верхнеамурская, нижнеамурская, желтопятнистая и крупночешуйная. По их мнению, две из них, верхнеамурскую и желтопятнистую, следует относить к одному виду, а нижнеамурскую и крупночешуйную формы следует на основании морфологических, генетических и фенотипических данных считать новыми видами. А.Л. Антонов [2004] описал крупночешуйную форму как Т. burejensis Antonov 2004, И.Б. Книжин с соавторами [2006] описывает желтопятнистую форму как Т. grubii flavomaculatus Knizin Antonov et Weiss 2006, нижнеамурскую как T. tugarinae Knizhin, Antonov, Safronov et Weiss, 2007 [Книжин и др., 2007]. Верхнеамурская форма стала номинативным подвидом хариуса, описанного Б. Дыбовским как Т. grubii grubii Dybowski, 1869. Кроме указанных видов, в р. Амур обнаружен ленский хариус [Антонов, Книжин, 2011], ареал которого охватывает верхнее и среднее течение р. Лена и некоторые реки бассейна озера Байкал [Матвеев и др., 2005, 2006; Книжин, 2008]. Эта форма описана Матвеевым с соавторами [2005] как подвид сибирского хариуса Т. arcticus baicalolenensis Matveyev, Samusenok, Pronin et Tel’pukhovsky, 2005.
Несмотря на проведенную ревизию, мнения о систематическом положении амурских хариусов до сих пор остаются противоречивыми. Так, например, некоторые авторы ставят под сомнение валидность описанных хариусов [Зиновьев, 2005 а,б]. Другие авторы повышают подвидовой ранг ленского, верхнеамурского и желтопятнистого хариуса до видового [Bogoutskaya et ah,

2008]. Описание ленской формы подвергается обоснованной критике [Книжин,
2009], по мнению авторов эту форму следует рассматривать в статусе вида [Книжин и др., 2008]. Эти примеры показывают необходимость дальнейших работ по уточнению таксономического положения амурских хариусов.
Интерес представляют филогенетические связи амурских хариусов и их положение относительно других представителей рода. Несмотря на множество проведенных молекулярно-генетических и палеонтологических работ, многие вопросы эволюции и расположение центров происхождения хариусовых рыб остаются неясными. По мнению ряда авторов [Световидов, 1936; Тугарина, 1981; Зиновьев, 2005а], широкую эволюционную радиацию хариусовые рыбы получили в Алтае-Саянском районе, где обитает один из наиболее древних представителей рода - монгольский хариус (Thymallus brevirostris (Kessler, 1879)). Современные исследования показали, что формирование этого вида произошло существенно позже европейского, сибирского, а также группы амурских хариусов [Koskinen et al., 2002; Книжин и др., 2008]. Учитывая число новоописанных видов и подвидов хариусов р. Амур, а также генетические различия по различным видам, И.Б. Книжин [2009] выдвигает Амурский бассейн, как один из возможных центров формирования рода хариусов, вместе с Алтае-Саянским регионом. Таким образом, вопросы центра происхождения хариусов и наиболее архаичных представителей рода до сих пор остаются нерешенными.
Э. Фруфе с соавторами [Froufe et al., 2005] выделил четыре монофилетические филогенетические линии для всего рода хариусов на основании контрольной области мтДНК. В одной из линий, буреинский хариус занимает базальное положение на дереве. Еще две линии полностью образованы амурскими видами хариусов: Т. tugarinae и Т. grubii. Такие данные показывают раннюю дивергенцию амурских хариусов от предковой формы, однако последовательность эволюционных событий, приведшая к формированию современных видов и форм амурских хариусов остается неясной. Кроме того, важной задачей в настоящее время является построение укорененного филогенетического дерева для основных представителей хариусовых рыб с

Основным фиксатором при сборах генетического материала служил 96% этиловый спирт С2Н5(ОН). В редких случаях, фиксатором выступал раствор 20% диметилсульфоксида (DMSO) и 0,25М 7,5 pH этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в насыщенном растворе хлорида натрия (NaCl). Фиксированную ткань подвергали дополнительной промывке в 96% спирте, с последующим высушиванием и промывкой в ТЕ-буфере (0,01М Трис, 0,5М ЭДТА, рН=8,0). Затем ткань гомогенизировали в этом же растворе в 1,5 мл пробирке с конусообразным дном с помощью пластикового пестика, после чего добавляли лизирующий раствор (300 мкл 10% SDS). Образцы перемешивались (500 об./мин.) с одновременным нагревом (50°С) на приборе Eppendorf Termomixer comfort до полного растворения ткани.
Выделение тотальной ДНК проводили двумя способами: фенол-
хлороформной экстракцией и кит-набором «ДНК-сорб-В» от компании «ИнтерЛабСервис». В первом случае, экстракцию ДНК проводили по стандартной методике [Маниатис и др., 1984] с использованием протеиназы К и последующей депротеинизацией фенолом и хлороформом, а также переосаждением изопропиловым и этиловым спиртами. Во втором случае, выделение проводилось по протоколу производителя с использованием универсального сорбента и комплекса отмывочных жидкостей.
Выделенная тотальная ДНК растворялась в ТЕ-буфере, в котором хранилась при температуре -20 “С. Продукты выделения ДНК проверялись на электрофорезе в 1,5% агарозном геле (МР Biomedicals), содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия, в 0,5Х буфере ТВЕ (0,445мМ Трис-HCl, 0,045мМ борная кислота, ЮмМ ЭДТА). Электрофорез проходил в камерах фирмы Bio-Rad, в зависимости от количества образцов использовались Sub-Cell 96 (51 лунка) и Mini sub-cell GT (15 лунок). Источник питания для камер - Bio-Rad PowerPac HV. Напряжение тока для камеры Sub-Cell 96 составляло 150 вольт, для Mini sub-cell GT - 100 вольт. Полученные гели фотографировали в проходящем УФ свете (длина волны 302 нм) с помощью гель-документирующей системы Bio-Rad Gel Doc XR+.