Антимикробные факторы в контроле внешней и внутренней среды мясных мух : Diptera, Calliphoridae

• Автор: Кругликова, Анастасия Анатольевна
• Шифр специальности: 03.02.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 125 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Введение

Глава I. Литературный обзор

1.1. Иммунная система насекомых

1.1.1. Клеточный иммунный ответ

1.1.1.1. Фагоцитоз

1.1.1.2. Образование узелков и капсул

1.1.2. Гуморальный иммунный ответ

1.1.2.1 .Антимикробные пептиды

1.1.2.2. Коагуляция гемолимфы

1.1.2.3. Фенолоксидазная система
1.1.2.4. Эпителиальный иммунный ответ
1.2. Личиночная терапия
1.2.1. Антибактериальные свойства экзосекрета
Глава II. Материалы и методы исследования
II. 1. Биологический материал
II. 1.1. Краткая характеристика основного модельного объекта исследования Імсіїіа
.чегісМа
II. 1.2. Методика лабораторного содержания
11.2. Методы
11.2.1. Инфицирование насекомых
11.2.1.1. Получение бактериальной суспензии для иммунизации
11.2.2. Сбор гемолимфы
11.2.3. Сбор экзосекрета
11.2.4. Анализ антимикробной активности
И.2.5. Анализ фунгицидной активности
II.2.6. Методы концентрации и очистки исследуемых образцов
11.2.6.1. Метод твердофазной экстракции
11.2.6.2. Хроматографическое фракционирование
И.2.7. Масс-спектрометрия
11.2.8. Методы исследования живых гемоцитов
11.2.9. Статистическая обработка экспериментальных данных
Глава III. Фунгицидная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Ьисіїіа хегісаіа
III. 1. Фунгицидная активность гемолгшфы личинок Ьисіїіа .чегісаіа

111.2.Фунгицидная активность цельного экзосекрета личинок Lucilia sericata, Calliphora vicina, Musca domestica
111.2.1. Фунгицидная активность экзосекрета Lucilia sericata
111.2.2. Фунгицидная активность экзосекрета Calliphora vicina
111.2.3. Фунгицидная активность экзосекрета Musca domestica
111.3. Фунгицидная активность фракционированного экзосскрста личинок Lucilia sericata
111.3.1. Фунгицидная активность гидрофобной фракции экзосскрета
111.3.2. Фунгицидная активность хроматографических фракций экзосекрета
111.4. Выводы
Глава IV. Антибактериальная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia
sericata
IV. 1. Антибактериальная активность цельных экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia
sericata
IV.2. Антибактериальная активность гидрофобных фракций экзосекрета и гемолимфы
личинок Lucilia sericata
IV.3. Антибактериальная активность хроматографических фракций экзосекрета и
гемолимфы личинок Lucilia sericata
IV.4. Выводы
Г лава V. Масс-спектрометрический анализ
Глава VI. Особенности клеточного состава гемолимфы личинок Lucilia sericata
VI. 1. Основные типы гемоцитов Lucilia sericata
VI.2. Иммунологические реакции гемоцитов
VI.3. Выводы
Глава VII. Обсуждение
VII.1. Фунгицидная активность гемолимфы и экзосекрета личинок Lucilia sericata
VII.2. Антибактериальная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata

VII.3. Особенности клеточного состава гемолимфы личинок Lucilia sericata
Заключение
Выводы
Список литературы

Введение
В естественных местообитаниях основными конкурентами личинок мух являются микроорганизмы, грибы и бактерии. Для личинок мясных мух характерно внекишсчное пищеварение, при котором питательный субстрат подвергается предварительной обработке пищеварительными ферментами (Виноградова, 1984).
Поскольку среда обитания личинок мух крайне агрессивна, экзосекрет этих насекомых, по всей видимости, должен содержать антимикробные и фунгицидные соединения. Некоторые виды насекомых, как и позвоночные (Weinbergl et al., 1998; Selsted et al., 1992), выделяют на поверхность слизистых оболочек антимикробные пептиды. Так у дрозофилы антимикробные пептиды обнаружены в нескольких видах эпителия, которые потенциально контактируют с окружающей средой; к ним относятся респираторный, пищеварительный, репродуктивный тракты, мальпигиевы сосуды и ротовые органы (Tzou et al., 2000). Для растений и грибов характерно использование вторичных метаболитов в качестве защиты от вредителей и патогенов, а также в борьбе с конкурентами (Seigler, 1999; Баринова и др., 2008). Для животных такие механизмы менее характерны. Но известно, что часть азота выделяется личинками мясных мух в форме аллантоина, образующегося в результате расщепления мочевой кислоты (Виноградова, 1984), который увеличивает значение pH, что косвенным образом подавляет развитие целого ряда микроорганизмов (Thomas et al., 1999).
Антимикробные пептиды, как известно, являются важнейшим элементом в иммунной системе насекомых, обеспечивая высокую устойчивость к широкому спектру патогенов и паразитов (Bulet et al., 1999; Hoffmaim, 1995). Большинство из них индуцибельны, характеризуются небольшим молекулярным весом и являются катионными молекулами (Hoffmann, 1995). Большая часть антимикробных пептидов синтезируется клетками жирового тела и выделяется в гемолимфу (Trenszec et Faye, 1988). Известно, что для дрозофилы, так же как и для млекопитающих, характерна ткаиеспецифичная продукция антимикробных пептидов (Tzou et al., 2000). Однако, у личинок L. sericata подобные особенности иммунного ответа до сих пор не были исследованы.
Мухи вида L. sericata имеют огромное экономическое и клиническое значение, поскольку являются первичными факультативными паразитами, вызывающими кожные миазы прежде всего у овец несмотря на то, что могут поражать и других диких и домашних животных и человека (Hall et Hall, 1995). Однако, эта особенность жизненного цикла личинок мух может быть использована человеком в собственных интересах. На

Глава III. Фунгицидная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata
111.1. Фунгицидная активность гемолимфы личинок Lucilia
sericata
Тестирование фунгицидной активности гемолимфы иммунизированных и интактных личинок /,. sericata проводилось на грибах видов Aspergillus flavus и Cladosporium sphaerospermum. Гемолимфа предварительно центрифугировалась 8 минут при 3000 об/мин в условиях комнатной температуры; надосад очная жидкость смешивалась с теплой питательной средой (бактериальный агар) в соотношении 1:5 (0,1 мл гемолимфы / 0,5 мл агара) в случае гемолимфы иммунизированных личинок и 1:1 (по 0,5 мл) в случае гемолимфы интактных личинок; в контроле -1,5 мл бактериального агара. Тестирование проводили в чашках Петри диаметром 40 мм, кусочек мицелия наносили в центр чашки уколом микологической иглы. Чашки инкубировались в термостате при постоянной температуре +25°С. Наблюдение за развитием грибных колоний производилось в течение 10 дней; замедленный рост мицелия (+) или отсутствие роста (-) свидетельствовали о фунгицидной или фунгистатической активности гемолимфы. Результаты анализа фунгицидной активности гемолимфы представлены в таблице (Таблица 1).
Таблица 1. Анализ фунгицидной и фунгистатической активности гемолимфы иммунизированных и интактных личинок L. sericata.
контроль гемолимфа имм. личинок гемолимфа инт. личинок День инкубации
A. flavus C. sphaerosp. A. flavus С. sphaerosp. A. flavus С. sphaerosp.

+++ споры + +
+++ споры ++ +
к - контроль
- - отсутствие роста ++ - умеренный рост
+ - незначительный рост +++ - активный рост