Холодоактивные липолитические ферменты психротрофных микроорганизмов, выделенных из многолетнемерзлых осадков

• Автор: Новотоцкая-Власова, Ксения Александровна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 171 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1 КРИОБИОСФЕРА КАК СРЕДА ОБИТАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

1.1 Вечная мерзлота и криопэги: определение, строение, физикохимические УСЛОВИЯ

1.2 Биоразнообразие бактерий М1 юголетнемерзлых пород

1.3 Биоразнообразие прокариот в криопэгах

1.4 Характеристика рода Рзуснловастек

ГЛАВА 2 АДАПТАЦИЯ ПРОКАРИОТ К НИЗКИМ ТЕМПЕРАТУРАМ

2.1 Физиологические группы бактерий по отношению к температуре..

2.2 Механизмы адаптации к низкой температуре
2.2.1 Изменение структуры и функций компонентов мембраны.
2.2.2 Синтез белков теплового шока
2.2.3 Белки холодового шока
2.2.4 Криопротекторы: белки и органические осмолиты
2.2.5 Холодоактивные белки
2.2.6 Анализ геномов и протеомов психрофилов
ГЛАВА 3 ХОЛОДОАКТИВНЫЕ ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
3.1 Основные свойства и биологические функции липолитических ферментов
3.2 Классификация бактериальных липаз
3.3 Особенности структуры холодоактивных липолитических ферментов

3.4 Продуценты холодоактивных липаз
3.5 Методы определения активности липаз
3.6 Применение холодоактивных липолитических ферментов в БИОТЕХНОЛОГИИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1 Объекты исследования
4.2 Районы исследования
4.3 Материалы
4.3.1 Штаммы Escherichia coli, вектор и среды для культивирования E.coli
4.3.2 Олигонуклеотиды
4.4 Микробиологические методы анализа
4.4.1 Оценка общей численности микроорганизмов
4.4.2 Накопительное культивирование и выделение чистых культур бактерий
4.4.3 Микроскопические методы исследования
4.4.4 Культивирование P. cryohalolentis
4.4.5 Определение липолитической активности
4.5 Молекулярно-генетические методы, использованные для изучения микроорганизмов
4.5.1 Выделение геномной ДНК
4.5.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
4.5.3 Определение нуклеотидных последовательностей генов 16SpPHK и филогенетический анализ
4.6 Молекулярно-генетические методы, использованные для получения рекомбинантных белков
4.6.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
4.6.2 Рестрикция
4.6.3 Электрофорез ДНК
4.6.4 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
4.6.5 Лигирование
4.6.6 Трансформация клеток E. coli
4.6.7 ПЦР-анализ клопов
4.6.8 Выделение плазмидной ДНК из Е. со И
4.6.9 Секвенирование ДНК
4.6.10 Конструирование экспрессионных векторов
4.7 Биохимические методы исследования
4.7.1 Денатурирующий электрофорез белков в ДСН-ПААГ
4.7.2 Оптимизация экспрессии в E.coli рекомбинантных белков
4.7.3 Выращивание рекомбинантных штаммов E.coli
4.7.4 Выделение рекомбинантных белков EstPc, LiplPc, ND1-ND5, LifPcd23 и LifPcd62 из клеток E. coli
4.7.5 Получение рекомбинантного белка Lip2Pc
4.7.6 Рефолдингрекомбинантного белка Lip2Pc
4.7.7 Очистка рекомбинантного белка Lip2Pc
4.7.8 Определение концентрации белка
4.7.9 Определение липолитической активности рекомбинантных белков
4.7.10 Характеристика свойств рекомбинантных белков
ГЛАВА 5 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
5.1 Криопэги как источник продуцентов холодоактивных липолитических ферментов
5.1.1 Микробиологическая характеристика исследуемых криопэгов
5.1.2 Скрининг на наличие липолитической активности у выделенных микроорганизмов
5.1.3 Морфологический и филогенетический анализ культур, давших положительный результат на липолитический скрининг

et al., 2002). Более подробно особенности структуры холодоактивных ферментов описаны в разделе 3.3.
2.2.6 Анализ геномов и протсомов психрофилов
Современное представление о молекулярных способах адаптации микроорганизмов к существованию в условиях пониженной температуры формируется на основе анализа 1) геномных последовательностей отдельных психрофильных микроорганизмов, а также 2) метагеномного и 3) протеомного анализа психрофилов. К настоящему времени установлены полные геномные последовательности 30 психроактивных микроорганизмов. Некоторые из них представлены в Таблице 4. Также доступен существенный объем данных метагеномного анализа геномных последовательностей, полученных из различных холодных местообитаний (Casanueva et al., 2010). Функциональный скрининг этих библиотек позволил идентифицировать несколько генов, кодирующих липазы, эстеразы и целлюлазы, адаптированные к низким температурам (Jeon et al., 2009; Berlemont et al., 2009).
На основе метагеномного анализа установлено, что ферменты, адаптированные к низким температурам, содержат меньше остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, аргинина и пролина. Они также содержат меньше гидрофобных аминокислот и внутримолекулярных ионных связей. Все эти особенности направлены на увеличение конформационной энтропии. Метагеномный анализ образцов ледникового происхождения выявил большое количество генов, ответственных за синтез криопротекторов, таких как глицин, бетаин, холин, саркозин и глютамат. Обнаружены также гены, продукты которых обеспечивают эластичность мембраны. К ним относятся гены, кодирующие ферменты, ответственные за синтез ненасыщенных жирных кислот, а также десатуразу, осуществляющую превращение насыщенных жирных кислот в ненасыщенные (Simon et al., 2009).