Фенотипическая и генотипическая характеристика метициллинрезистентных представителей вида Staphylococcus aureus

• Автор: Гостев, Владимир Валерьевич
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Общая характеристика работы
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Генетическое строение и классификация SCCmec
1.2. Эволюция MRSA
1.3. Происхождение тесА и SCC - элементов
1.4. CA-MRSA
1.5. Организация генома S.aureus
1.6. Глобально распространенные генетические линии MRSA
1.7. Проблема устойчивости стафилококков к гликопептидам
1.7.1. VRSA
1.7.2. hetero - VISA, VISA
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Фенотипические методы исследования
2.1.1. Выделение, идентификация и хранение изолятов
2.1.2. Определение чувствительности к антибактериальным препаратам
2.1.3. Определение МПК к ванкомицину с помощью Е-тестов
2.2. Генотипические методы
2.2.1. Постановка ПЦР (выделение ДНК, амплификация, электрофорез)
2.2.2. SCCmec типирование
2.2.3. Типирование детерминант резистентности
2.2.4. Типирование детерминант вирулентности
2.2.5. Типирование agr
2.2.6. Мультилокусное сиквенс типирование
2.2.7. Полногеномное секвенирование
2.2.7.1. Выделение геномной ДНК
2.2.7.2. Подготовка ShotGun библиотек ДНК и проведение эмПЦР
2.2.7.3. Сборка генома
2.3. Обработка результатов исследования
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Распределение изолятов по источнику выделения
3.2. Фенотипическая оценка микробиологической активности
антибиотиков

3.2.1. Бета - лактамы и цефтаролин
3.2.2. Ванкомицин и даптомицин
3.2.3. Макролиды, линкозамиды, фторхинолоны
3.2.4. Аминогликозиды
3.2.5. Ко-тримоксазол, мупироцин, фузидиевая кислота
3.2.6. Тигециклин, линезолид и препараты сравнения тетрациклин,
хлорамфеникол
3.3. Генотипирование MRS А
3.3.1. Результаты SCCmec - типирования
3.3.2. Результаты MLST- и agr- типирования
3.3.3. Результаты типирования детерминант вирулентности
3.4. SCCmec типы и ассоциированная устойчивость к антибиотикам
3.4.1. Характеристика механизмов резистентности у MRSA с разными SCCmec типами
3.4.2. SCCmec и профили резистентности
3.5. Результаты полногеномного секвенирования
3.5.1. Описание изолята и результаты секвенирования
3.5.2. Структурная организация генома, сравнение геномов
3.5.3. Анализ дополнительной части генома
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Микробиологическая активность известных и новых
антибиотиков
4.2. Генотипы MRSA
Заключение
Выводы
Практические рекомендации
Список сокращений
Благодарности
Список литературы
Приложение
Приложение

Общая характеристика работы Актуальность исследования
Staphylococcus aureus относят к условным патогенам, инфекции кожи и мягких тканей -наиболее частые нозологические формы, вызываемые S. aureus, однако бактерии могут вызывать инфекционные процессы практически любой локализации [1]. После внедрения в медицинскую практику пенициллина в 1940 годах летальность от стафилококковых инфекций стала снижаться в разы, даже несмотря на уже описываемые в то время, пенициллинустойчивые изоляты S. aureus. Ситуация кардинальным образом меняется в 1961 году, когда в Англии, впервые были описаны метициллинрезистентные стафилококки (methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA) [2-3]. Важнейшей особенностью таких стафилококков является устойчивость ко всем бета-лактамным антибиотикам, что определяет особенности тактики антибактериальной терапии. Позже, с 1980 годов появляются госпитальные клоны MRS А с ассоциированной устойчивостью почти ко всем препаратам, используемых в медицинской практике в то время [4]. Особенностью MRS А является наличие уникального мобильного генетического элемента — стафилококковой хромосомной тес - кассеты (Staphylococcal Cassette Chromosome mec, SCC mec), в состав которой входит ген тес А, кодирующий измененный пенициллинсвязывающий белок (РВР2а), опосредующий устойчивость к бета-лактамам [5]. В структуру SCCтес способны интегрироваться различные детерминанты устойчивости к другим антибиотикам, что объясняет феномен ассоциированной устойчивости MRSA. Сформировавшиеся таким образом госпитальные штаммы образуют особый кластер MRSA: HA-MRSA (Hospital associated MRSA) [4]. HA-MRSA пандемично распространены по всему миру, но можно выделить наиболее «успешный» эпидемический клон - ST239, который циркулирует и в нашей стране [6-8]. Но, к сожалению, в России отсутствуют систематизированные данные о циркуляции MRSA, их детальной молекулярной эпидемиологии, данные о происхождении эпидемических клонов и динамика их антибиотикорезистентности.
На сегодняшний день MRSA остаются одними из актуальных возбудителей госпитальных инфекций, терапия которых является серьезной проблемой. Так, например, в США от инфекций, вызываемых MRS А, ежегодно погибает около 20 ООО человек [9]. В Европе регистрируется около 200 тысяч случаев MRSA инфекций из которых 7% заканчиваются летальным исходом [10]. Основу лечения MRSA инфекций составляет ванкомицин, однако, появление изолятов со сниженной чувствительностью к этому антибиотику (Vancomycin intermediate Staphylococcus aureus - VISA) [11] ставит под сомнение его эффективность.

производителей: линезолид (LNZ) и тигециклин (TGC, «Pfizer», США), цефтаролин (СРТ, «AstraZeneca», Англия), арбекацин (ARB, «Meiji», Япония). Постановку опыта проводил в 96 луночных планшетах для иммуноферментного анализа (НПО «Медполимер», Санкт-Петербург). В каждом планшете делали 11 разведений (ряды 1-11) с 2 - х кратным шагом, 12 лунка использовалась как контроль роста. Один планшет содержал 8 антибиотиков (ряды А-Н). Диапазоны МПК тестируемых антибиотиков представлены в таблице 2. За МПК принимали лунку в ряде разведений, где отсутствовал видимый рост культуры при положительном росте контрольной лунке. Для оценки чувствительности к ванкомицину (VAN) и даптомицину (DAP) использовали готовые планшеты Sensititre в бульоне САМИ - TES buffer («TREK Diagnostic Systems», США). Базовые растворы антибиотиков хранили не более 6 месяцев при -70°С, рабочие растворы использовали ex tempore. В качестве контрольных культур были использованы S.aureus АТСС 29213, S.aureus Mu50 (МПК VAN = 4-8 мкг/мл), клинический изолят hVISA 2533/00 (МПК =2-4 мкг/мл).
Таблица 2. Тестируемые препараты и диапазон МПК, использованные в исследовании
Антибиотик Диапазон МПК, мкг/мл Антибиотик Диапазон МПК, мкг/мл
Оксациллин 0,25-512 Мупироцин 0
Цефокситин 0,25-512 Фузидиевая кислота 0
Ванкомицин 0,016-16 Ко-тримоксазол 0
Даптомицин 0,008- 16 Эритромицин 0
Линезолид 0,016- 16 Клиндамицин 0
Тигециклин 0,004 - 4 Хлорамфеникол 0
Тетрациклин 0,06 - 64 Ципрофлоксацин 0
Г ентамицин 0,125 - 128 Моксифлоксацин 0
Арбекацин 0,125 -128 Цефтаролин 0
2.1.3. Определение МПК к ванкомицину с помощью Е-тестов
Дополнительно у 68 изолятов определяли МПК к ванкомицину с использованием Е-тестов двух производителей («Oxoid», Англия и «BioMerieux», Франция) и на агаре Mueller Hinton («BioMerieux», Франция). Постановку Е-тестов осуществляли в двух вариациях: с
бактериальной взвесью 0,5 и 2 по стандарту мутности McF, результаты учитывали через 24 и 48 часов.