Совершенствование лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза

• Автор: Гречишникова, Ольга Геннадьевна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

1.1.2.Методы обнаружения и дифференциации Chlamydia trachomatis ,

1.1.3. Особенности верификации Chlamydia trachomatis при урогенитальном

хламидиозе

1.2. Типирование хламидий

1.3.Устойчивость Chlamydia trachomatis к антибиотикам

Глава 2. Материалы и методы исследований

2.1. Материалы исследования
2.1.2. Образцы клинического материала
2.1.3. Штаммы микроорганизмов
2.1.4. Культуры клеток
2.1.5. Используемые питательные среды и буферы
2.2. Лабораторные методы исследования
2.2.1. Цитологический метод
2.2.2. Серологический метод
2.2.3. Культуральный метод
2.2.4. Молекулярно-генетические методы
2.3. Программное обеспечение в молекулярно-генетическом исследовании хламидий
2.4. Статистическая обработка полученных данных
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Сравнительная характеристика информативности методов верификации Chlamydia trachomatis в зависимости от характера течения инфекционного про-

3.2. Разработка ПЦР-системы для одновременного выявления и видовой дифференциации ДНК Chlamydophyla pneumoniae и Chlamydia trachomatis, а так же ПЦР-системы для верификации штаммов Chlamydia trachomatis, выделенных от человека, с наличием, либо отсутствием участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды
3.3.Разработка способа молекулярно-генетического типирования методом ПЦР и анализ наличия генетических детерминант антибиотикорезистентности штаммов Chlamydia trachomatis ...■
3.4. Оптимизация проведения диагностики хламидиоза культуральным методом
3.5. Оптимизация алгоритма лабораторной диагностики хламидиоза
Глава 4. Обсуждение полученных результатов
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы

Список сокращений
АТ антитело
ВЗОМТ воспалительные заболевания органов малого таза
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА иммуноферментный анализ
КМ культуральный метод
ЛПС (LPS) липополисахарид
ЛЦР лигазная цепная реакция
МАНК метод амплификации нуклеиновых кислот
МОМР (major outer membrane protein) основной белок наружной мембраны
НИФ реакция непрямой иммунофлуоресценции
ПДРФ полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
ПИФ реакция прямой иммунофлуоресценции
ПЦР полимеразная цепная реакция
РНГА реакция непрямой гемагглютинации
РНК рибонуклеиновая кислота
рРНК рибосомальная РНК
тРНК транспортная РНК
РТ ретикулярное тельце
УГТ урогенитальный тракт
УГХ урогенитальный хламидиоз
ФИТЦ флуоресцинизотиоцианат
ЭТ элементарное тельце
Ig иммуноглобулин
NASBA Nucleic Acid Sequence-Based Amplificaition

плификации проводили разделением фрагментов ДНК в 2% агарозном геле. Все этапы проведения ПЦР выполнялись согласно инструкции производителя.
Для видовой мультиплексной детекции и идентификации Chi pneumoniae и Ch. trachomatis впервые были применены подобранные оригинальные универсальные праймеры на фрагмент гена 16S рРНК: форвард праймер для Ch.trachomatis Ctr: 5'-TGSSGRTWTYTGGGCAYCC-3' (СР000051 Gene Bank), форвард праймер для Chi. pneumoniae Cpn: 5'-CGRMATAAYGACTTYRGTTG -3' (AE002161 Gene Bank), общий реверс праймер для обоих видов R: 5'-CTYSTTTWCCTGGYACGCYC-3' (АЕ001363 Gene Bank). Размер амплифици-руемого продукта определяли с помощью маркера длин фрагментов 1000-100 п.н. в концентрации 0,5 мкг/мкл в буфере для нанесения на гель (ЗАО «Си-лекс», г. Москва). Размер продукта амплифицируемого фрагмента гена 16S рРНК для Chi. pneumoniae - 440 пар нуклеотидов, для Ch. trachomatis - 334 пары нуклеотидов.
Для детекции штаммов Ch.trachomatis, несущих участок нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды и свободных от него, была впервые предложена следующая оригинальная комбинация праймеров: форвард праймер Ctr: 5'-TGCCGGTATGTGGGCAACC-3' и реверс праймер R: 5'-CTCGTTTACCTGGGACGCAC-31 для амплификации фрагмента (334 пары нуклеотидов) 16S рРНК гена Ch. trachomatis', форвард праймер PLf: 5'-TTCGAGGCGAGTAACGAAGA-3' (ХО6707 Gene Bank) и реверс праймер PLr: 5'-AAGCAACGCGCGCGATAGGT-3' (АМ886279 Gene Bank) для амплификации участка криптической плазмиды (241 пара нуклеотидов) Ch. trachomatis.
Выделение ДНК из биологических жидкостей для ПЦР с оригинальными праймерами проводили с помощью набора «Выделение ДНК и РНК из биологических жидкостей на магнитных частицах» (ЗАО «Силекс», г. Москва). Выделенную ДНК хранили в замороженном виде при -20 °С с дальнейшим использованием в реакции ПЦР.