Получение, детекция и характеристика некультивируемых клеток бактерий

• Автор: Пахомов, Юрий Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 142 с. : ил.

Оглавление
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Понятие и виды покоя, его роль в жизненном цикле бактериальной клетки

1.2 Общие свойства клеточных форм переживания неблагоприятных условий

1.3 Теории, объясняющие жизнеспособное, но некультивируемое состояние микроорганизмов

1.4 Образование и свойства некультивируемых форм микроорганизмов

1.5 Специализированные анабиотические покоящиеся формы микроорганизмов

1.6 Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий

1.7 Условия образования и структура цистоподобных покоящихся клеток неспорообразующих микроорганизмов
1.8 Регуляция образования цистоподобных покоящихся клеток аутоиндукторами анабиоза
1.9 Фенотипическая вариабельность в популяции микроорганизмов и ее роль в поддержании гомеостаза популяции
1.10 Связь покоящегося состояния и фенотипической диссоциации
1.11 Выход микроорганизмов из состояния покоя
1.12 Детекция некультивируемых форм микроорганизмов
Заключение к литературному обзору
Экспериментальная часть
Глава 2 Материалы и методы
2.1 Штаммы, питательные среды, реагенты и биологические препараты
2.2 Выращивание микроорганизмов для получения некультивируемых форм

2.3 Количественное определение общей численности бактерий, жизнеспособных клеток, колониеобразующих единиц, оптической плотности
суспензий
2.4 Определение активности низина
2.5 Процедуры, использованные для реанимации некультивируемых форм микроорганизмов
2.6 Статистическая обработка результатов
Глава 3. Получение некультивируемых клеток условно патогенных и
сапротрофных микроорганизмов
Глава 4. Получение некультивируемых клеток Гяс/ососснх /ясй'х евр. /ясґй, характеристика их жизнеспособности и бактериоцинпродуцирующей активности
4.1 Получение некультивируемых форм и изучение динамики сохранения жизнеспособности лактококков
4.2 Низинпродуцирующая активность популяции лактококков в условиях стресса
Глава 5. Обнаружение некультивируемых клеток бактерий в коммерческих пробиотических препаратах
5.1 Изучение жизнеспособности пробиотических бактерий в коммерческих препаратах
5.2 Сравнительный анализ определения жизнеспособности клеток в пробиотических препаратах методами люминесцентной микроскопии и проточной цитометрии
Глава 6. Поиск факторов, способствующих переходу некультивируемых
клеток в вегетативное состояние
Заключение
Выводы
Список использованной литературы

Введение
Актуальность проблемы. Известно, что в неблагоприятных условиях естественной или искусственной среды обитания (исчерпание источников питания и энергии, неоптимальные уровни температурного воздействия, аэрации, влияние химических веществ, токсинов органической природы и т.д.) неспорообразующие микроорганизмы подвергаются стрессу, результатом которого является образование клетками некультивируемых и покоящихся форм (Романова Ю.М., Гинцбург А.Л., 1993; Литвин В.Ю. и др., 1998; Oliver J.D. 1995; 2010; Mukamolova G.V. et al., 1998; Бухарин О.В. и др., 2005; Ganesan В. et al., 2007; Lahtinen S.J. et al., 2008; Мулюкин А.Л., 2010b; Романова Ю.М., 2010; Hoefman S. et al., 2012; Ушакова H.A. и др. 2012). При этом, выходя из пролиферативного цикла, клетки сохраняют потенциальную возможность вернуться к активному росту и размножению. За таким состоянием обратимой потери культивируемое закрепился термин «жизнеспособное, но некультивируемое» (viable but non culturable - VBNC) (Oliver J.D. 1995; 2005; 2010) (ЖНС). Выявление микроорганизмов, находящихся в некультивируемом состоянии (НС), в окружающей среде, организме человека и животных, в пищевых продуктах и др. является важным направлением микробиологических исследований. Некоторые микроорганизмы образуют некультивируемые формы (НФ) только под воздействием специфического комплекса стрессов. Каждый из них или их последовательное действие обусловливает принципиально другие результаты (Chen S.Y. et al., 2008, Lai C.J. et al.,2009).
Некультивируемое состояние разделяют по степени его глубины. Так, при некоторых стрессовых воздействиях метаболизм тормозится, но его можно выявить, или он полностью прекращается. Например, в стационарной фазе в условиях пролиферативного покоя клетка сохраняет метаболическую активность (Бухарин О.В. и др., 2005). При другом виде покоя происходит постепенное торможение обменных процессов (Бухарин О.В. и др., 2005, 2010, Мулюкин A.JI., 20106). При аметаболизме (анабиоз, криптобиоз, абиоз) (Sussman A.S.,

Обладая антиоксидантной активностью, алкилоксибензолы, накапливающиеся в клетках стационарной фазы и покоящихся клетках, участвуют в формировании неферментативной антиоксидантной защиты мембранных липидов и других клеточных структур (El-Registan G.I. et al., 2005). Это является особенно важным в условиях ингибирования метаболических активностей клетки. (El-Registan G.I. et al., 2005; Ильинская O.H. и др., 2002а, б) показали, что АОБ играет важную роль в защите клеток микроорганизмов от различных стрессов. В ответ на стрессовые воздействия, такие как, например, тепловой шок, уровень их биосинтеза резко повышается (El-Registan G.I. et al., 2005). Фактор di способен образовывать межмолекулярные водородные связи, вступать в гидрофобные и ионные взаимодействия (Мулюкин АЛ. и др., 2005, Давыдова O.K. и др., 2005). Эти свойства определяют механизм их действия при развитии метаболического блока в клетке.
Алкилоксибензолы модифицируют мембранные липиды, вследствие чего увеличивается ее микровязкость из-за образования водородных связей между ароматическим кольцом алкилоксибензола и молекулами фосфолипидов (Кап-рельянц A.C. и др., 1987). Это приводит к увеличению проницаемости мембраны для одновалентных катионов, несущих гидратационые рубашки, и затем к обезвоживанию протопласта клетки. В мембране также образуются микропоры, через которые происходит выход воды из клеток. Вследствие снижения жидкости мембран ингибируются их транспортные, энергопродуцирующие и другие функции, прекращаются синтетические процессы, а также активность связанных с мембраной интегрированных в нее ферментов (деполимераз и автолизи-нов). Это обеспечивает структурную целостность клеточных оболочек покоящихся клеток.
Обусловленное дегидратацией мембраны ингибирование клеточных ферментов усиливается еще и тем, что молекулы алкилоксибензолов образуют комплексы с молекулами биополимеров за счет слабых физико-химических взаимодействий, изменяя их конформацию (El-Registan G.I. et al., 2005; Степа-