Получение и анализ Tn5-мутантов Sinorhizobium meliloti с измененными поверхностными полисахаридами

• Автор: Затовская, Татьяна Викторовна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 182 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ПОЛИСАХАРИДЫ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ: СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ В БОБОВО-РИЗОБИАЛЬНОМ СИМБИОЗЕ, ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ СИНТЕЗА

1.1. Строение клеточной оболочки грам-отрицательных бактерий

1.2. Липополисахариды У. теШоН и других клубеньковых бактерий

1.3. Капсулярные полисахариды У теШоН

1.4. Экзополисахариды клубеньковых бактерий

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы иплазмиды
2.2. Среды для выращивания бактерий
2.3. Микробиологические методы
2.4. Методы работы с ДНК
2.5. Методы анализа ЛПС
2.6. Получение секретируемых белков и иммуноблотинг
2.7. Обнаружение активности Р-глюкуронидазы в клетках У. теШой
2.8. Оценка симбиотических свойств У. теШоН
2.9. Микроскопическое исследование клубеньков
2.10. Статистическая и компьютерная обработка данных
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ Тп5-МУТАНТОВ У. МЕЫЮТ1С ИЗМЕНЕННЫМИ
ПОВЕРХНОСТНЫМИ ПОЛИСАХАРИДАМИ И АНАЛИЗ ИХ СИМБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
3.1. Получение мутантов У. теШоН с измененными поверхностными полисахаридами
3.2. Саузерн-блот гибридизация ДНК мутантов с Тп5-зондом
3.3. Анализ ЛПС мутантов электрофорезом в полиакриламидном геле с ДСН
3.4. Анализ капсулярных полисахаридов
3.5. Трансдукция генов с Тп5-инсерциями из мутантов в родительский штамм
СХМ1-188У. теШоН
3.6. Анализ симбиотических свойств мутантов
3.7. Симбиотический фенотип мутантов Тг53 и ТгбЗ

3.8. Электронно-микроскопический анализ клубеньков, образованных мутантами
Тг53 и ТгбЗ
3.9. Анализ нетипичных клубеньков, образованных мутантом Тг53
ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Тп5 - МУТАНТОВ
С ИЗМЕНЕННЫМИ ПОВЕРХНОСТНЫМИ ПОЛИСАХАРИДАМИ
4.1. Идентификация генов, инактивированных Тп5-инсерциями у мутантов
4.2. Сравнительный анализ липополисахаридов родительского штамма
СХМ1-188 5. теЫоН и ЛПС-мутантов Тэ22 и ТЬ29
4.3. Изучение ШС мутанта ТгбЗ, дефектного в продукции экзополисахаридов
4.4. Изучение рИЬА мутанта Тб 152 5. теШоН
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
ПРИЛОЖЕНИЕ

Список сокращений
Символы, используемые для обозначения некоторых фенотипов ризобиальных штаммов:
SmR, KmR, ApR - устойчивость к антибиотикам стрептомицину, канамицину, ампициллину, соответственно. Чувствительность к антибиотикам обозначали теми же буквами с надстрочной буквой ”S ”.
ГЖХ - газо-жидкостная хроматография, жк - жирная кислота.
ДСН-ПААГ - электрофорез - электрофорез в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия.
ЛПС - липополисахариды, КПС - капсулярные полисахариды,
ЭПС - экзополисахариды;
ПОМ - полиоксимасляная кислота;
п.н. - пары нуклеотидов, т.п.н. - тысячи пар нуклеотидов.
Fix(+) - образование азотфиксирующиих клубеньков, Fix(-) - образование неактивных (не фиксирующих азот) клубеньков.
Обозначения для сахаров: ДГК - дезоксигептулазаровая кислота,
КДО - 2-кето-З-дезокси-октулозоновая кислота, Glc - глюкоза, Gal - галактоза,
Мал - манноза, GlcA - глюкуроновая кислота, GalA - галактуроновая кислота,
Ху1 - ксилоза, Ram - рамноза, Fuc - фукоза.
Реактивы: ДОХ - дезоксихолат натрия, ДСН (или SDS) - додецилсульфат натрия,
ДТТ - дитиотрейтол,
Трис - трис(гидроксиметил)-аминометан, Трис-НС1 - раствор триса с добавлением НС1 до определенного pH,
APS - персульфат аммония,
CHAPS - 3-[(3-холамидопропил)-диметил-аммоний]-пропан-сульфонат,
DMSO - диметилсульфоксид,
EDTA-Na - этилендиаминтетраацетат натрия,
HEPES - N-2-гидрокси-пиперазин - N ’ - 2 - этансульфоновая кислота,
IPTG - изопропилтио-р-галактозид,
MOPS - 3-(4-морфолино)пропансульфокислота,
ТАЕ - трйс-ацетатный буфер,
TEMED - N,N,N’,N’- тетраметилэтилендиамин,
X-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-В-галактозид,
X-GlcA - циклогексил-аммониевая соль 4-хлор-3-индолил-0-глюкуроновой кислоты.

S. meliloti содержит две копии генов nodPQ. Мутации в обеих группах генов nodPQ отменяют сульфитацию ЛПС (Cedergren et al., 1995). На хромосоме был выявлен ген IpsS, кодирующий сульфотрансферазу ЛПС (Cronan, Keating, 2004). Мутация в гене IpsS снижала сульфотрансферазную активность S. meliloti на 89%. Предполагают, что у S. meliloti существует еще одна сульфотрансфераза, участвующая в сульфатировании ЛПС. IpsS мутант формировал эффективный симбиоз с М. sativa. Ген IpsS регулируется глобальным транскрипционным регулятором ExoR. Показано, что у S. meliloti ген IpsS экспрессируется в клубеньках (Cronan, Keating, 2004).
Кроме того, в мембранах шт. 1021 S. meliloti был обнаружен изопреноидный липид Сбо, связанный с галактуроновой кислотой, а также его менее насыщенный аналог Сб5 (Kanjilal-Kolar, Raetz, 2006). У R. leguminosarum изопреноидный липид Сбо переносит галактуроновую кислоту ко второму остатку КДО корового олигосахарида (Kanjilal-Kolar, Raetz, 2006). Галактуроновая кислота входит в состав кора у штамма 1021 5. meliloti (Ferguson et al., 2002). Присутствие изопреноидного липида, связанного с галактуроновой кислотой, позволяет предположить, что S', meliloti имеет такой же механизм переноса галактуроната к кору, как и R. leguminosarum (Kanjilal-Kolar, Raetz, 2006).
Данные о выявленных генах, необходимых для синтеза корового олигосахарида у S. meliloti, сведены нами в таблице 1.1.
Таблица 1.1.
Гены, детерминирующие синтез корового олигосахарида у S. meliloti, и симбиотический фенотип ЛПС-мутантов штамма 1021 S. meliloti.
Локализация Функция Фенотип мутантов
Ген в геноме белка в симбиозе с люцерной
5. теШоН М. sativa M. truncatula
IpsB хромосома гликозилтрансфераза синтеза кора Fix(+) Fix(-)
IpsC хромосома гликозилтрансфераза синтеза кора Fix(+) Fix(-)
IpsD хромосома гликозилтрансфераза синтеза кора Fix(+) Fix(-)
IpsE хромосома гликозилтрансфераза синтеза кора F ix(+) Fix(-)
exoC хромосома фосфоглюкомутаза Fix(+) H.o.
exoB рБутВ У ДФ-глкжозо-4-эпимераза Fix(-) Fix(-)
rkpK хромосома У ДФ-глюкозо-дегидрогеназа Fix(+) Fix(-)
IpsL хромосома УДФ-глюкуронат-эпимераза Fix(+) Fix(-)
ddhB рБутВ ЦТД-глюкозо-6-дегидрогеназа Fix(+) Fix(-)
IpsS хромосома сульфотрансфераза Fix(+) H.o.