Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба и конструирование на их основе диагностических препаратов

• Автор: Кузнецова, Екатерина Михайловна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 150 с. : ил.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВМ - внешняя мембрана
ДИА - дот-иммуноанализ
ИДТЛ - иммуноглобулины диагностические туляремийные
люминесцирующие ИФА - иммуноферментный анализ
КОЕ - колониеобразующая единица
ЛПБК - липополисахаридо-белковый комплекс
ЛПС - липополисахарид
м.к. - микробная клетка
МкАт - моноклональные антитела
МФА - метод флуоресцирующих антител
НАФ - неполный адъювант Фрейнда
НКС - нормальная кроличья сыворотка
НЛС - нормальная лошадиная сыворотка
ООИ - особо опасные инфекции
п.н. - пар нуклеотидов
ПТТР - полимеразная цепная реакция
РА - реакция агглютинации
РДП - реакция диффузионной преципитации в агаровом слое
РЛА - реакция латекс агглютинации
РНАт - реакция нейтрализации антител
РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия
DCL - абсолютная летальная доза
ed50 - средняя иммунизирующая доза
LD50 - доза летальная для 50 % животных
NTS - блокирующий буферный раствор
PBS - фосфатно-солевой буферный раствор
SDS - додецилсульфат натрия
SDS- PAGE -электрофорез в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия
присутствии

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Дифференциация подвидов Ргапсіяеііа ШІагежія
1.2. Структурно-функциональная характеристика основных 19 антигенов туляремийного микроба
1.3. Способы детекции и идентификации возбудителя туляремии 32 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Питательные среды и условия культивирования штаммов
2.3. Реактивы и лабораторные животные
2.4. Получение антигенов и их комплексов
2.5. Получение кроличьих иммунных сывороток и антительных препаратов
2.6. Биохимические и иммунохимические методы исследования
2.7. Иммунологические методы исследования
2.8. Статистическая обработка 48 ГЛАВА 3. ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННЫХ
КОМПЛЕКСОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА И ХАРАКТЕРИСТИКА ИХ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА
3.1. Идентификация компонентного состава протективного антигенного комплекса туляремийного микроба
3.2. Оптимизация способов получения антигенных компонентов протективного антигенного комплекса туляремийного микроба и их характеристика
3.2.1. Химический гидролиз протективного антигенного комплекса
3.2.2. Ферментативный гидролиза протективного антигенного комплекса
3.3. Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба

ногистохимиии и иммуноэлектронной микроскопии [Dennis D. Т. et al., 2001; DeBey
В. М. et al., 2002; Zeidner N. S. et al., 2004]. A. Hotta с соавт. (2007) были сконструированы флуорохромные конъюгаты на основе МкАт к различным антигенным эпитопам возбудителя туляремии, некоторые из них позволили идентифицировать помимо штаммов F. tularensis также F. philomiragia.
Наиболее распространенными серологическими методами диагностики туляремии и являются РА и РНГА, которые широко используются в отечественной и зарубежной практике [Levesque В. et al., 1995; Пекшев А. В., 1998; Gutierrez М. P. et al., 2003; Николаев В. Б., 2004; Никифоров В. В., Кареткина Г. Н., 2007; Hotta A. et al., 2011]. В РФ в настоящее время выпускается ряд сертифицированных препаратов для реакции агглютинации и реакции непрямой гемоагглютинации, чувствительность которых в среднем составляет 3,12х 106 - 6,25*10б м.к./мл [Сырова Н. А. и др., 2008]. Вместе с тем данные методы имеют ряд недостатков, среди которых нестабильность входящих в их состав реагентов, наличие ложноположительных и ложноотрицательных результатов, а для РНГА также длительность учета результата (окончательный результат требует 16-18 ч.) [Николаев В. Б., 2004]. При обследовании природных очагов туляремии широко применяется РНАт, позволяющая выявлять 106 м.к./мл возбудителя, однако РНАт относительно сложна в постановке и занимает 4-5 ч [Мещерякова И. С. и др., 1988; Лаб. диагност. ООН, 2009]. И.В. Жарниковой (2004, 2005) сконструирован диагностикум для реакции суспензионной агглютинации (РСА) на основе кремнеземов с иммобилизованными туляремийными иммуноглобулинами, чувствительность которого составляет 1,56х10б - 3,12x10б м.к./мл, время постановки реакции- 1-5 мин. Разработан липосомальный иммуноанализ (ЛИА) для выявления специфических антител и ЛПС-антигена F. tularensis. При этом чувствительность ЛИА при определении ЛИС составила 50-100 нг/мл, а при введении в систему, содержащую МкАт, антител-активаторов для достижения комплементзависимого лизиса ли-посом - 5-10 нг/мл [Скопинская С. Н. и др., 1993]. Предложен автоматизированный количественный агглютинационный тест (АКАТ) на основе РНГА для иммунодетекции возбудителя туляремии, позволяющий достоверно оценивать результаты реакции и определять количественное содержание антигенов в исследуемом образце. РНГА-АКАТ обладает высокой специфичностью и выявляет штаммы F. tularensis 3-х подвидов в концентрации бактериальных клеток 103-104 КОЕ/мл, а ЛПС- 0,25 нг/мл [Ко-