Исследование путей транспорта и катаболизма глюкозы в клетках Pantoea ananatis

• Автор: Андреева, Ирина Георгиевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 142 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность

Цели и задачи

Научная новизна и практическая значимость работы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л Реконструкция метаболизма в масштабах генома

1ЛЛ Аннотация генома

1Л Л Л Картирование генов

1ЛЛ.2 Базы данных аннотированных геномов

1ЛЛ.З Функциональная аннотация
1Л .2 Метаболическая реконструкция
1Л.2Л Анализ пробелов в метаболической реконструкции
1 Л.2.2 Метаболические модели
1Л .2.3 Приложения метаболических реконструкций
1.1.3 Заключение
1.2 Центральный метаболизм
1.2.1 Транспорт глюкозы
1.2.1.1 Фосфоенолпируват зависимая фосфотрансферазная система
1.2.1.2 MFS- суперсемейство мембранных транспортеров
1.2.1.3 Суперсехмейство АВС-транспортеров
1.2.1.4 Использование PTS-альтернативного транспорта глюкозы в штаммах-продуцентах
1.2.1.5 Коутилизация сахаров
1.2.1.6 Глюкозодегидрогеназная реакция
1.2.2 Утилизация глюкозы
1.2.2.1 Путь Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса
1.2.2.2 Пентозофосфатный путь
1.2.2.3 Путь Энтнера-Дудорова

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2Л Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2 Среды
2.3 Проведение полимеразной цепной реакции
2.4 Генно-инженерные методики
2.5 Трансформация клеток P. ananatis плазмидной ДНК
с помощью процедуры электропорации
2.6 Трансформация клеток P. ananatis геномной ДНК
с помощью процедуры электропорации
2.7 X Red-зависимая интеграция двухцепочечных фрагментов ДНК в хромосому
2.8 Излечивание клеток от плазмиды-помощника pRSFRedTer
2.9 Конструирование интегративных кассет для инактивации генов
в P. ananatis
2.10 Конструирование плазмид pAH162-KmR, p-Pir-cat, рАН 123-саД рАН129-са
2.11 Излечивание клеток P. ananatis от термочувствительных плазмид-помощников pMW-Xlnt/Xis-cat, рАН123-саГ, рАН129-са?
2.12 Интеграция в хромосому P. ananatis с помощью метода «Dual-In-Out»
2.13 In vivo клонирование pqq оперона P. ananatis
2.14 Конструирование точки интеграции ф80attB в хромосоме P. ananatis
2.15 Интеграция CRIM плазмиды, рАН162-рад в сайт ф80attB в хромосоме
P. ananatis
2.16 Выщепление плазмидной части
2.17 Конструирование интегративных кассет, несущих гены ТГ-симпортёров P. ananatis
2.18 Конструирование штаммов E.coli, несущих гены Н-симпортёров
galР, fiicР, xylE из P. ananatis
2.19 Конструирование штаммов P. ananatis, несущих промоторы разной длинны: Р's„tKU. PgM//orl/2, P'u-Short перед репортёрным геном lacZ
2.20 Олигонуклеотиды
2.21 Измерение накопления глюконовой кислоты в культуральной среде
2.22 Измерение глюкозодегидрогеназной активности в мембранной фракции

2.23 Измерение накопления PQQ в культуральной среде
2.24 Измерение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности в грубых экстрактах
2.25 Измерение 6-фосфоглюконатдегидрогеназной активности в грубых экстрактах
2.26 Измерение кривых роста
2.27 Аннотация генома
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1 Реконструкция метаболизма D-глюкозы
3.1.1 Структура генома Р. ananatis AJ13355
3.1.2 Потенциальные пути поступления D-глюкозы в клетки Р. ananatis
3.1.3 Возможные пути потребления D-глюкозы в клетках Р. ananatis
3.2 Экспериментальная проверка предложенной схемы центрального метаболизма
3.2.1 Инактивация основных путей поступления глюкозы в клетки
Р. ananatis
3.2.2 Участие предполагаемых Н+- симпортеров GalP, XylE и FucP
в транспорте глюкозы в клетки Р. ananatis
3.2.3 Р. ananatis способна к внеклеточному окислению D-глюкозы до D-глюконовой кислоты
3.2.3.1 Глюкозодегидрогеназная активность в мембранных фракциях
Р. ananatis
3.2.3.2 Клонированиеpqq оперона и влияние его экспрессии
на продукцию PQQ клетками Р. ananatis и E
3.2.4 Транспорт D-глюконовой кислоты в клетки Р. ananatis
3.2.4 Пути катаболизма глюкозо-6-фосфата и 6-фосфоглюконовой кислоты в клетках Р. ananatis
3.2.4.1 Основная точка ветвления катаболизма D-глюкозы: конструирование штаммов, несущих различные комбинации мутаций Apgi Agcd, Azwf и анализ их роста
3.2.4.2 Проверка функциональной активности геновpzwf и pgnd
3.2.4.2.1 Клонирование генов pzwf и pgnd
3.2.4.2.2 Измерение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
в штамме SC17(0)Azw/Apzn// RSFP/ac-pznf/:

кодирующего EIICBg,c почти полностью подавлена в ЕсуаА или Асгр мутантах (Rephaeli and Saier, 1980), тем самым из-за малого количества транспортера глюкозы в таких мутантах, добавление последней в ростовую среду не ведет к дефосфорилированию P~EIIAGIc, как в штамме дикого типа.
Надо отметить, что не только изменение активности аденилатциклазы может регулировать внутриклеточную концентрацию с АМР: нуклеотид может экскретироваться из клетки в среду (Hantke et al., 2011); может разрушаться с помощью фермента сАМР-фосфодиэстеразы (Nielsen et al., 1973). Экспорт сАМР является основным споособом поддержания внутриклеточной концентрации сАМР. В работе Makman и Sutherland (Мактап and Sutherland, 1965) было отмечено, что при добавлении глюкозы к голодающей E. coli прекращается синтез сАМР, а накопленный сАМР выводится в среду. Интересно, что сгр мутанты выводят больше сАМР, чем клетки дикого типа (Botsford and Drexler, 1978; Potter et al., 1974). В работах Goldenbaum и Hall для E.coli была впервые показана возможность энергозависимого экспорта сАМР из клетки и его облегчённой диффузии внутрь клетки (Goldenbaum and Hale, 1979). Позже был идентифицирован транспортный белок TolC и ген, его кодирующий (Hantke et al., 2011).
Следует отметить, что, хотя сАМР обнаружен в клетках большинства исследованных прокариотических и эукариотических микроорганизмов, он не всегда имеет отношение к катаболитной репрессии. У некоторых бактерий, жизненный цикл которых характеризуется чередованием стадий с различной морфологией клеток, например у Arthrobacter crystallopoeticus и Myxococcus xantus, сАМР играет некоторую роль в морфогенезе. В ряде случаев, например у псевдомонад, его функции пока не известны.
Однако, указанный механизм действия комплекса сАМР-Сгр не
является единственным и наиболее распространенным в регуляции
экспрессии катаболических оперонов даже у E. coli. Как уже упоминалось,
рАЯТ-мутанты не способны расти не только на PTS-субстратах, но и на не-
PTS-субстратах. В то же время клетки с “ослабляющей” мутацией ptsH или