Аммонийокисляющие бактерии и археи в почвах европейской части России

• Автор: Черобаева, Анна Сергеевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. Особенности биохимии, физиологии и экологии нитрифицирующих бактерий и архей
1.1. Физиолого-биохимические особенности нитрификаторов
1.2. Филогения и экология нитрифицирующих микроорганизмов
1.3. Молекулярно-биологические методы исследования аммоний-окисляющих микроорганизмов
1.4. Влияние экологических факторов среды на активность и состав сообществ аммонийокисляющих бактерий и архей в почвах
1.5. Роль нитрификации в образовании окислов азота
1.6. Вклад аммонийокисляющих архей в процесс нитрификации в разных типах почв
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение и поддержание накопительных культур аммонийокисляющие бактерий
2.2.2. Установка микрокосмов
2.2.3. Постановка эксперимента с замораживанием-размораживанием микрокосмов
2.2.4. Определение интенсивности нитрификации в почве
2.2.5. Методы выделения препарата ДНК из почвенных образцов
2.2.6. Амплификация фрагментов генов 168 рРНК и атоА
2.2.7. Количественный ПНР анализ (реал-тайм ПЦР)
2.2.8. Электрофорез в денатурирующем градиентном геле (ДГТЭ)
2.2.9. Клонирование и секвенирование
2.2.10. Анализ нуклеотидных и белковых последовательностей
2.2.11. Депонирование полученных последовательностей

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Анализ состава и численности аммонийокислягащих бактерий и архей в разных типах почв
3.1. Оптимизация молекулярно-биологических методов для анализа аммонийокисляющих бактерий и архей в зональных почвах
3.1 Л. Сравнительный анализ концентраций ДНК в препаратах, выделенных разными методами
3.1.2. ПНР анализ фрагментов генов 16Б рРНК и атоА аммонийокисляющих бактерий и архей
3.1.3. ДГГЭ анализ фрагментов гена 16Б рРНК аммонийокисляющих бактерий и архей из препаратов ДНК, полученных разными методами
3.1.4. Подбор оптимальных условий ДГГЭ анализа фрагмента функционального гена атоА аммонийокисляющих бактерий
3.2. Анализ состава сообщества аммонийокисляющих бактерий методом молекулярного клонирования
3.3. Количественный анализ сообщества аммонийокисляющих бактерий
и архей с помощью реал-тайм ПЦР
3.4. Изучение состава сообщества аммонийокисляющих архей на основе ДГГЭ анализа фрагмента функционального гена атоА
3.5. Влияние изменения температуры на нитрифицирующую активность и состав сообщества нитрификаторов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Деятельность нитрифицирующих микроорганизмов во многом определяет характер протекания других процессов биологического цикла азота в почвах, их активность является одним из важнейших источников нитратов в почве (Кудеяров, 1999).
Последние достижения молекулярной биологии изменили сложившиеся представления о цикле азота, протекающем в почвах и океанах. Есть основание полагать, что существенный вклад в процесс нитрификации вносят не только автотрофные нитрифицирующие бактерии и гетеротрофные микроорганизмы, но также и недавно открытые аммонийокисляющие археи (Könneke et al., 2005). Способность к органотрофному и миксотрофному росту свидетельствует о наличии у них более гибкого механизма адаптации к неблагоприятным факторам окружающей среды по сравнению с нитрифицирующими бактериями, что определяет широкое распространение архей в почвах и морских экосистемах (Leininger et al., 2006, Nicol et al., 2006). Из-за сложности методических приемов идентификации, аммонийокисляющие археи в почвах России до настоящего времени остаются мало исследованы.
Целыо работы являлось изучение разнообразия нитрифицирующих бактерий, определение численности аммонийокисляющих бактерий и архей в основных типах почв европейской части России методами молекулярной биологии.
Задачи исследования:
• сравнить эффективность известных методов выделения ДНК из почв и разработать собственные модификации. Адаптировать ПЦР и ДГГЭ методы для анализа аммонийокисляющих бактерий и архей в разных типах почв.
• проанализировать разнообразие микробных сообществ аммонийокисляющих бактерий в накопительных культурах и почвенных образцах.
1.5. Роль нитрификации в образовании окислов
азота
Хотя ведущая роль биогенных источников в образовании и поступлении в атмосферу окислов азота не вызывает сомнений, до настоящего времени нет однозначных оценок масштабов этих процессов в природе, в особенности для закиси азота (N20). Большая неопределенность возникает при оценке размеров продукции окиси азота (NO). Вместе с тем, имеются данные о более высоком уровне эмиссии NO из хорошо аэрируемых почв как природных, так и агроэкосистем. NO, как и N20, участвует в разрушении озонового слоя в тропосфере и формировании кислых дождей.
Существенный вклад в образование окислов азота в почвах вносят автотрофные нитрификаторы. Более 30 лет назад Т. Иошида и М. Александер (Yoshida, Alexander, 1970) впервые показали, что Nitrosomonas еигораеа выделяет N20 при окислении аммония или гидроксиламина до нитрита. Затем, с использованием ,5N соединений, было установлено, что при инкубации клеток в среде с аммонием и нитритом в атмосфере 0,1% 02 большая часть N20 образуется из нитрита. При этом образование N20 бактериями в анаэробных условиях связано с восстановлением нитритредуктазой нитритов, а в аэробных условиях - с сопряженным окислением аммония в нитриты. Последующие работы с 15N меткой подтвердили, что выделение N20 бактериями группы Nitrosomonas является восстановительным процессом, в котором микроорганизм использует нитрит как акцептор электронов, особенно если ограничено снабжение кислородом. Это позволяет сохранить 02 для окисления аммония (в результате чего автотрофный нитрификатор получает энергию для роста и размножения) и предотвратить накопление нитрита в токсичных концентрациях.
Таким образом, хемолитоавтотрофные аммонийокисляющие бактерии (нитрификаторы I фазы) способны к денитрификации с образованием NO, N20 и N2.