Новая секретируемая металлоэндопептидаза Bacillus intermedius

• Автор: Рудакова, Наталья Леонидовна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Современные аспекты классификации протеолитических

ферментов

2. Характеристика ферментов клана метцинкинов

2 Л Астациноподобные эндопептидазы

2.2 Серрализины

2.3 Матриксные металлоэндопептидазы

2.4 Адамализины/репрализины

3. Структурные особенности метцинкиновых эндопептидаз

4. Функциональная роль и перспективы применения
метцинкинов в медицинской практике
5. Заключение
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Штаммы и плазмиды
2. Условия культивирования рекомбинантного штамма
3. Определение локализации фермента
4. Определение белка
5. Определение протеолитической активности
6. Выделение и очистка протеиназы рекомбинантного
штамма
7. Электрофорез в ПААГ '
8. Влияние ингибиторов на активность металлопротеиназы
МргЕЯ
9. Масс-спектрометрический анализ (МАЕЭКТОР)
10.Определение М-концевой последовательности белка
11. Определение субстратной специфичности фермента

12.Каталитичекие и энзиматические свойства металл опротеиназы МргВ!
13.Математическая обработка результатов РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Среды для культивирования рекомбинантного штамма
В. 8иЫШз
2. Динамика роста и накопления металлопротеиназы
МргВ)' в культуральной жидкости рекомбинантного штамма В. тЬИИх
3. Локализация металлопротеиназы МргВ! в клетках
рекомбинантного штамма В. зиЫШя
4. Подбор компонентов питательной среды для
максимальной продукции металлоэндопептидазы МргВ1 рекомбинантного штамма В. ниЫШз
5. Разработка способов очистки металлопротеиназы
МргВц электрофорез и молекулярная масса белка
6. Влияние ингибиторов на активность металлопротеиназы
МргВ!
7. Определение последовательности аминокислот и Ы-
концевой аминокислоты металлоэндопептидазы
8. Сравнительный анализ первичной структуры
металлопротеиназы МргВ1 с ферментами клана метцинкинов
9. Субстратная специфичность МргВ
10. Кинетические параметры
11. рН-Оптимум и рН-стабильность МргВ
12. Температурный оптимум и термостабильность
13. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность
металлопротеиназы МргВ

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
пХМБ - пара-хлормеркурибензоат
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ДЭАЭ-целлюлоза - диэтиламиноэтилцеллюлоза
ПААТ - полиакриламидный гель
•SDS (sodium dodecyl sulfate) - додецил сульфат натрия
SP-сефадекс - сульфопропил-сефедекс
TIMPs - тканевые ингибиторы металлопротеиназ
Кт - константа Михаэлиса
kcat - каталитическая константа
рI- изоэлектрическая точка
кДа - килодальтон
Аминокислоты
Cys - цистеин (С)
His - гистидин (Н)
•Asp - аспарагиновая кислота (D) Ser - серии (S)
Lys - лизин (К)
Glu - глутаминовая кислота (Е) Gly - глицин (G)
Met - метионин (М)
Phe - фенилаланин (F)
Не - изолейцин (I)
Val - валин (V)
Asn - аспарагин (N) Ala - аланин (А)
Pro - пролин (Р)
Thr - треонин (Т)
Туг - тирозин (Y) Leu - лейцин (L)
Arg - аргинин (R) Gin - глутамин (Q) Тгр — триптофан (W)

'состояния во время каталитического акта [Yiallouros et al., 2000]. Участие Tyr 149 в субстратном связывании подтверждено при изучении абсорбционных спектров Cu-астацинового мутанта [Gomis-Rüth et al., 1994а].
Пятый цинковый лиганд, являющийся донором протона в реакции катализа, не известен для семейств матриксинов и адамализинов/репролизинов, у которых остаток Тугі49 заменен, в основном, на нефункциональный остаток пролина, не принимающий участия в каталитическом акте (рис. 4). Эти эндопептидазы содержат цистеин в N-концевом пропептиде, который отщепляется при протеолитическом 'процессинге. Так, в пропептиде эндопептидаз змеиного яда (адамализин II) идентифицирована консервативная последовательность PKMCGVT, в которой тиоловая группа цистеина связана с цинком активного центра зимогена, предотвращая тем самым активацию фермента. При удалении пропептида снимается ингибирующее действие цистеина и возникает связь цинка с активированной« молекулой; воды. (четвертый цинковый лиганд), необходимой для осуществления катализа [Grams et al., 1993, Hite et al., 1992, Stöcker et al., 1995а]. Подобный механизм цистеинового переключателя был обнаружен в продоменах стромелизина-1 (про ММР-3) и желатиназы А '(про ММР-2 и других ферментах семейства матриксинов), в которых цистеин консервативной последовательности PRCGVPD связывался с цинком активного центра протеазного домена, поддерживая молекулу фермента в неактивном состоянии. Протеолитический процессинг активировал молекулу фермента. Установлено, что Asp232 консервативен почти для всех матриксинов, который, по видимому, способствует фиксированию N-конца активированного энзима. Замена Asp232 на Туг приводит к альтернативному способу проэнзимной активации [Sato et al., 1994]. Механизм блокирования активного центра (цистеиновый переключатель) предполагают у 'лейшманолизина, продомен которого содержит консервативную последовательность HRCIHD [Gomis-Rüth et al., 2003].