Субпопуляции стареющих культур неспорообразующих бактерий: разделение в криогелях и морфо-физиологическая характеристика

• Автор: Евтюгин, Владимир Геннадьевич
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 119 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ответ микроорганизмов на стрессовые воздействия

1.1.1. Переход бактерий в гипометаболическое состояние при старении культур. Физиолого-биохимические и морфологические изменения
1.1.2. Индукция покоящегося состояния у бактерий аутоиндукторами группы ашшлрезорцинов

1.1.3. Типы клеточных поверхностей бактерий в связи с их адгезивными свойствами

1.2. Криотропное гелеобразование

1.2.1. Криогели, образующиеся при реакциях поликонденсации

1.2.2. Криогели с физической сеткой полимерной фазы

1.3. Области применения материалов на основе полимерных криогелей
1.3.1. Криогели в биологии
1.3.2. Разделение бактериальных популяций в модифицированных криогелях
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты и материалы
2.1.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования
2.1.2. Ауторегуляторные факторы микроорганизмов
2.1.3. Полимерные криогели
2.2. Микробиологические и биохимические методы анализа
2.2.1. Оценка жизнеспособности бактерий при длительном
инкубировании и голодании
2.2.2 Тест Ко£иге для определения числа жизнеспособных, но некультивируемых клеток
2.3. Химические методы анализа
2.3.1. Хроматографическое определение алкилрезорцинов
2.4 Физические методы анализа
2.4.1 Электронная микроскопия
2.4.2 Элементный анализ проб культуральной жидкости
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Изменение морфологии клеток при переходе в гипометаболическое состояние
3.2. Определение гексилрезорцина в суспензиях бактериальных клеток с помощью ВЭЖХ
3.3. Физиологические изменения грамположительных и грамотрицательных клеток в условиях длительного культивирования в присутствии факторов анабиоза
3.4. Изменение активности конститутивных ферментов в клетках стареющей популяции микроорганизмов и при действии гексилрезорцина
3.5. Изменение активности и биосинтеза ф-галактозидазы при действии гексилрезорцина
3.6. Гель-хроматография клеток бактерий в ПВС криогелях с привитыми алифатическими группировками
3.7. Разделение по гидрофобности криогелями ПВС клеток с предварительным внесением алкилрезорцинов
3.8. Гель-хроматография клеток бактерий в агарозных криогелях с привитыми алифатическими группировками
3.9. Гель-хроматография в агарозных криогелях с привитыми заряженными группировками
3.10. Морфология гипометаболическш клеток микроорганизмов после разделения в криогелях
3.11. Элементный анализ клеток бактерий в гипометаболическом состоянии после разделения в криогелях
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АР - алкилрезорцины;
АОБ - алкилоксибензолы;
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; Диет. - дистиллированная;
ДМСО - диметилсульфоксид;
КГПВС - композитные криогели поливинилового спирта; КЖ - культуральная жидкость;
КОЕ - колониеобразующие единицы;
НФ - некультивируемые формы бактерий;
ПВС - поливиниловый спирт;
ПФ - покоящиеся формы бактерий;
ТТТТР - полимеразная цепная реакция;
СЭМ - сканирующая электронная микроскопия; трис - трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорид; Т-буфер - 0.1 М раствор трис;
ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия;
ФЭК - фотоэлектроколориметр;
Hex - гексилрезорцин.
Met - метилрезорцин;
R - резорцин;

1.2.1 Криогели, образующиеся при реакциях поликонденсации
Получение гелевых структур поликонденсацией мономерных предшественников - один из наиболее распространенных путей формирования сольватированных полимерных сеток [Папков, 1974; Кис!е1а, 1987; Тапака, 1987; Филиппова, 2000; Шиц, 1972; Иржак с соавт., 1974; Роговина, Слонимский, 1974]. Таким способом можно получить весьма разнообразные по своим свойствам структуры: мутные ячеистые криогели, имеющие сообщающиеся макропоры микрометрового (4-5 мкм) размера, похожие на пенопласт материал с изолированными макропорами или прозрачный полимерный монолит. Все зависит от концентрации мономера, а также от воздействия других факторов, например излучения. По данной методике формируют гели на основе 2-гидроксиэтилметакрилата, метакрилатов метилового эфира, олигоэтиленгликоля, диакрилатов, диметакрилатов [Лозинский, 2002].
Таким образом, варьированием концентрации и природы мономерных предшественников и режима кристаллизации удается в широких пределах изменять физические и химические свойства продуктов криополимеризации, в том числе, радиационной, которые используют в качестве носителей .иммобилизируемых ферментов [Китакига, КаЩэи, 1989; Китакига, 2001], антител [Китакига, КаШэи, 1983], небелковых биополимеров [вШат, 2001], и клеток микроорганизмов [Риртига, КаЩэи, 1982; Китакига, КаШэи, 1983; Риртига, КаПэи, 1987].
Примером могут служить полиакриламидные криогели, обладающие губчатой морфологией, которая определяется главным образом температурным режимом криотропного гелеобразования. На рисунке представлены микрофотографии, которые демонстрируют структуру криогелей, синтезированных при -10 и -20°С из одинаковых растворов сомономеров, замороженных различными способами: помещением растворов реагентов в криостат с заданной температурой (замораживание сверху);