Молекулярный и микробиологический мониторинг становления микрофлоры кишечника новорожденных

• Автор: Донских, Екатерина Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Нормальная микрофлора кишечника и её значение для здоровья

ребёнка

1.2. Бифидобактерии и их значение для здоровья человека

1.3. Молекулярно-генетические исследования микрофлоры

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Пациенты, методика забора и транспортировки материала. Бактериологическое исследование микрофлоры кишечника
2.2. Выделение штаммов бифидобактерий из клинического материала
2.3. Выделение тотальной ДНК из штаммов бифидобактерий и идентификация изолятов
2.4. Методы статистической обработки
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Микробиологический мониторинг интестинальной микрофлоры
у детей
3.2. Исследование интестинальной микрофлоры матерей
3.3. Сравнительный анализ видового состава бифидобактерий у людей различного возраста
3.4. Сравнительный анализ штаммов бифидобактерий кишечной микрофлоры матерей и детей при помощи молекулярно-генетических методов
Глава 4. Обсуждение результатов
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:
1. КОЕ - колониеобразующая единица
2. ПЦР - полимеразно-цепная реакция
3. рДНК - рибосомальная ДНК
4. рРНК - рибосомальная РНК
5. ТГФ-|3 - трансформирующий фактор роста
6. М - среднее значение величин
7. m - стандартное отклонение от средней величины
8. п — количество образцов
9. REP-ПЦР - амплификация повторяющихся элементов геномной ДНК
10.RAPD-ПЦР - случайно амплифицированные полиморфные ДНК
1 l.(H2S+/lec+) - сероводородпродуцирующие, лецитиназопозитивные
12.(H2S+/lec-) - сероводородпродуцирующие, лецитиназонегативные
13.(lac+/hem+) - лактозопозитивные, гемолизин продуцирующие
14.(lac+/hem-) - лактозопозитивные, гемолизин не продуцирующие
15.(lac-/hem-) - лактозонегативные, гемолизин не продуцирующие
16.(lac-/hem+) - лактозонегативные, гемолизин продуцирующие
17.NF-kB - нуклеарный фактор(протеиновый комплекс) контролирующий транскрипцию ДНК
18. IkB - ингибитор кВ 19.IL - интерлейкин
20.GALT (gut-associated lymphoid tissue) - лимфоидная ткань кишечника
21.HLA (human leukocyte antigen) - лейкоцитарный антиген человека

ВВЕДЕНИЕ.
Поверхность слизистых оболочек является местом наиболее тесного взаимодействия организма хозяина с колонизирующими его микроорганизмами, причем слизистая кишечника представляет собой наиболее значительную область такого контакта. Являясь местом обитания многочисленного бактериального сообщества, отделенного от внутренней среды организма только монослоем эпителиальных клеток, кишечник адаптирован для двусторонних обменных процессов хозяин-микрофлора. Количество резидентных бактерий, обитающих в кишечнике, десятикратно превосходит число человеческих соматических клеток, а совокупный микробный геном намного превышает геном человека (171). Структура и состав кишечной микрофлоры отражает процессы естественного отбора, протекающие как внутри самого микробного сообщества, так и на уровне его взаимодействия с организмом хозяина.
Роль нормальной индигенной микрофлоры все еще недостаточно изучена, но одна из наиболее важных ее функций, вероятно, заключается в поддержании колонизационной резистентности против внешней паразитарной экспансии, а также в контроле за чрезмерным ростом потенциальных патогенов, уже присутствующих в кишечнике (8). Антагонистическая активность индигенной микрофлоры обусловлена различными механизмами, прежде всего биохимическими: способностью продуцировать органические кислоты,
бактериоцины и другие антимикробные субстанции (24; 197).
Формирование нормальной микрофлоры кишечника человека начинается еще на самых ранних этапах жизни. Считается, что первичным источником бактерий колонизирующих пищеварительный тракт ребенка являются родовые пути матери, во время прохождения которых новорожденный заглатывает их содержимое вместе с бактериями вагинальной микрофлоры. После рождения колонизация кишечника ребенка продолжается не только штаммами бактерий

Все семьи проживали в городе Москве.
Материалом для исследования являлись фекалии. Транспортировка исследуемого материала осуществлялась во флаконах с плотно притертыми резиновыми пробками, заполненными газом или транспортной тиогликолевой средой (2мл) для защиты облигатно-анаэробных бактерий от действия кислорода. От момента забора материала до момента посева проходило не более 2 часов. В бактериологической лаборатории к навеске фекалий добавляли десятикратный объём физиологического раствора и гомогенизировали в фарфоровой ступке. Из полученного гомогената готовили десятикратные серийные разведения от КГ3 до 10'8. Флаконы с тиогликолевой средой взвешивали до и после взятия материала, далее готовили десятикратные разведения. Далее по 0,1 мл из соответствующих разведений исследуемого материала засевали на элективные питательные среды.
Для выделения бифидобактерий использовали среду Бактофок для бифидобактерий (Гидробиос, Россия) с добавлением 1,5% агара (Бегуа, США). Посев производился из 10'7 и 10'8 разведений. Чашки Петри с посевами инкубировались при 37°С в течение 48 часов в анаэробных условиях. Для их создания использовались микроанаэростаты (ОХОГО, Англия). После закрытия анаэростата из него откачивали воздух при помощи вакуумного насоса, затем анаэростат заполняли газовой смесью (85% N2, 10% С02, 5% Н2) и помещали в термостат. Для удаления оставшегося кислорода в анаэростат помещали палладиевые катализаторы, предварительно регенерированные в сухожаровом шкафу при температуре 175-180°С в течение 1 часа.
После 48- и 72-часовой инкубации чашки с выросшими колониями изучали макро- и микроскопически. На поверхности плотной питательной среды бифидобактерии образуют гладкие, ровные, выпуклые колонии, белого или кремового цвета, диаметром 1-1,5 мм. Из всех типов колоний делали мазки и окрашивали по Граму. В мазке бифидобактерии имеют вид прямых или слегка