Структура гена новой металлопротеиназы Bacillus intermedius и регуляция его экспрессии

• Автор: Сабирова, Альбина Рушановна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 150 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Механизмы адаптации бацилл

1.1. Системы глобальной регуляции

1.2. Двухкомпонентные системы трансдукции сигнала

2. Секретом бацилл

3. Основы геноинформационного анализа

4. Протеиназы бацилл

4.1 Клан метцинкинов

4.2. Клан мембраносвязанных металлопротеиназ (ММ) Заключение

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы бактерий, векторы, плазмиды и среды культивирования
Выделение плазмидной ДНК
Электрофорез
Рестрикционное картирование ДНК Трансформация клеток В. subtilis плазмидной ДНК Трансформация протопластов В. subtil is
Определение протеолитической активности металопротеиназы Определение активности на синтетических субстратах Исследование влияния ингибиторов на активность фермента ДНК секвенирование Субклонирование ДНК
Геноинформационный анализ последовательности ДНК Статистическая обработка данных РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Получение и характеристика рекомбинантного штамма B.subtilis
2. Секвенирование, построение контига и рестрикционный анализ фрагмента хромосомной ДНК В. intermedius
3. Идентифицкация открытых рамок считывания
4. Субклонирование гена металлопротеиназы
5. Анализ регуляторной области гена mprBi
6. Регуляция экспрессии гена металлопротеиназы В. intermedius
6.1. Влияние углеродной катаболитной репрессии на
экспрессиию гена mprBi
6.2. Влияние DegU-фактора транскрипции на экспрессиию гена
mprBi
6.3. Влияние азотной катаболитной репрессии на экспрессию
гена mprBi
6.4. Экспрессия гена mprBi в регуляторном штамме, дефектном
по фактору транскрипции ТпгА
6.5. Экспрессия гена mprBi в штамме B.subtilis, дефектном по
белкам GlnK и AratB
6.5. Влияние Spo-регуляторных белков на экпрессию гена mprBi
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Изоляция гена металлопротеиназы B.intermedius, его
идентификация и структура
2. Характеристика экспрессии адамализиноподобной
протеиназы В. intermedins
ВЫВОДЫ
Список литературы
Приложение

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Аіа Аланин
Аэр Аспарагиновая кислота
Аэп Аспарагин
Геи Лейцин
ТЬг Треонин
С1у Глицин
С1и Глутаминовая кислота
Суэ Цистеин
сШТР дезоксирибонуклеозидтрифосфаты
ааытр дидезоксирибонуклеозиды
Тас] Ткегтш aquaticus
РНК Рибонуклеиновая кислота
ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота
ПЦР Полимеразная цепная реакция
8Б Область Шайна-Дальгарно
кДа Килодальтон
КЬ килобазы
ОРС открытая рамка считывания
Нм нанометры
РІУКБ Фенилметилсульфонилфторид
ББР Диизопропилфторфосфат
ЗББ Додецилсульфат натрия
Трис 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3 -диол
ЭДТА Этилендиаминтетраацетат
ДМФА Диметил формамид
Еш Эритромицин
ьв Среда Лурия-Бертони
рИА Пара-нитроанилид
Протеом бактерий включает в себя белки различной локализации: белки цитоплазмы, цитоплазматической мембраны, клеточной стенки периплазмы, окружающей среды. Конечное назначение белка определяется наличием или отсутствием сигнального пептида.
Секвенирование генома В.Искеп'фгтЬ показало наличие 82 структурных генов, кодирующих секретируемые белки и ферменты. Сравнительный анализ с геномной последовательностью В.зиЫШя 168 показал присутствие 27 генов, кодирующих внеклеточные белки в геномной ДНК В.Искеп'фгпш, которые не идентифицируются в геноме В.йиЫШз 168 [Ыеу е1 а1., 2004].
В секретоме В.йиЬиШ, состоящем предположительно из 200 белков, 90 - внеклеточные белки (приложение №1). Среди них 53 белка обозначены как У-белки с неизвестной функцией, однако для 20 У-белков можно установить предположительную функциональную роль по сравнительному анализу аминокислотной последовательности с последовательностями белков, хранящихся в базах данных. Идентифицированы внеклеточные белки В.яиЬйНя - протеазы, или пептидазы, ферменты, вовлеченные в метаболизм аминокислот, углеводородов, ферменты, ассоциированные с ДНК и РНК, липазы, щелочные фосфатазы, фосфодиэстеразы, ферменты, участвующие в биогенезе клеточной стенки, липопротеины (многие из них субстрат-связывающие компоненты транспортных систем), белки,
вовлеченные в детоксификацию, жгутико-ассоциированные белки,
предположительные транскрипционные регуляторы, белки, контролирующие синтез и фолдинг белков, профаг-ассоциированные белки, специфические белки споруляции и белки с неустановленной функцией [Т)а1зта е! а1., 2000].
Некоторые белки с доменами, связывающимися с клеточной стенкой, обнаружены во внеклеточном секретоме - Ь}ДО, VapA, УосН, УусЕ и УуФ. Среди них ЬуЙЗ и КуЧС-белки вовлечены в биогенез клеточной стенки, VprA - протеаза, локализированная в клеточной стенке, ЗУарА -