Изменения в структуре ДНК у мутантов ассоциативных альфапротеобактерий Azospirillum brasilense по жгутикованию и социальному поведению

• Автор: Ковтунов, Евгений Анатольевич
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 107 с. : ил.

Содержание
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Краткая характеристика ассоциативного растительно-микробного

взаимодействия и ассоциативных бактерий рода АгоярігіПит

1.2 Основные гликополимеры поверхности бактериальной клетки

1.3 Бактериальные жгутики

1.4 Социальное поведение бактерий

Глава 2 ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Бактериальные штаммы и плазмиды

2.2 Питательные среды и условия культивирования бактерий
2.3 Растения, использованные в работе, и условия их выращивания
2.4 Инсерционный мутагенез бактерий
2.5 Анализ плазмидного состава бактерий. Препаративное выделение
плазмидной и тотальной ДНК. Клонирование ДНК
2.6 Секвенирование ДНК. Биоинформационный анализ нуклеотидных и
предсказанных аминокислотных последовательностей
2.7 Анализ жирнокислотного состава бактериальных клеток
2.8 Изучение индивидуальной и социальной подвижности бактерий
2.9 Характеристика бактериальных биопленок
2.10 Изучение бактериальной колонизации корней проростков пшеницы
2.11 Просвечивающая электронная микроскопия
2.12 Статистическая обработка результатов
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Характеристика кодирующих последовательностей р85, прилегающих к
месту вставки вектора рІБЕЗбО у мутанта
А. ЬгаяИепяе ВК570 с ускоренным роением
3.2 Генетико-физиологическая характеристика омегонового мутанта А.ЬгаэИете БК039, имеющего дефекты в образовании полярного
жгутика и роении
3.2.1 Анализ первичной структуры ДНК, прилегающей к вставке омего на у
мутанта А. Ьтьііете БК039, имеющего дефекты в образовании полярного жгутика и роении. Идентификация кодирующих последовательностей и характеристика предсказанных продуктов их

трансляции
3.2.2 Сравнение скорости роста бактерий А. Ьгаяііете Бр245 и БК039 в
присутствии разных источников азота и (или) углерода
3.2.3 Характеристика жирнокислотного состава клеток Л. bra.silen.se Бр245 и
БК039, выращенных на богатых и бедных средах разной плотности
3.3 Получение и характеристика новых омегоновых мутантов А. Ьга$іІеюе
Бр245 с изменениями в социальной подвижности
3.3.1 Получение омегоновых мутантов А. brasilen.se Бр245 с дефектами в
жгутиковании и подвижности и анализ их культуральноморфологических свойств
3.3.2 Анализ первичной структуры ДНК, прилегающей к вставке омегона у мутантов Л. brasilen.se 8р245.1063 и А. brasilen.se 8р245.1610.
Идентификация кодирующих последовательностей и характеристика предсказанных продуктов их трансляции
3.3.2.1 Инсерционный мутагенез хромосомной копии гена ДИВ сопровождается дефектами в образовании полярного и латеральных жгутиков у бактерий штамма^, йгсш/егае Бр245.1
3.3.2.2 Инактивация плазмидного гена/аЬа, кодирующего гомолог
3-оксоацил-[ацил-переносящий белок]-редуктазы, и блокирование образования латеральных жгутиков и работающего полярного жгутика у бактерий штамма И. ЪгавИете 8р245.1
3.4 Формирование биопленок на абиотических поверхностях штаммом
А. Ьгазіїете 8р245 и его мутантами, дефектными по роению
3.5 Колонизация корней проростков пшеницы бактериями штамма А. brasilen.se 8р245 и его мутантами с измененными
полисахаридами
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список сокращений и условных обозначений
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Объект диссертационного исследования - стимулирующие рост растений почвенные альфапротеобактерии вида Azospirillum brasilense. Эти бактерии обладают разнообразными характеристиками, существенными для взаимовыгодного ассоциативного взаимодействия с растениями: способностью к азотфиксации и денитрификации, синтезу фитогормонов, аэротаксису и хемотаксису, индивидуальной (активное плавание в жидкостях) и социальной (роение или распространение по влажным поверхностям с образованием микроколоний) подвижности, формированию биопленок на растениях и др.
Посредством активного передвижения (A. brasilense имеют редко встречающееся смешанное жгутикование), используя межклеточную коммуникацию и микромодификацию внешней среды, азоспириллы заселяют новые территории, в том числе, фитосферу. Эти бактерии распространены в разнообразных климатических поясах и приспособлены как к самостоятельному существованию, так и к формированию ассоциаций с широким кругом растений (Assmus et al., 1995; Bashan, Holguin, 1997; Molina-Favero et al., 2008; Spaepen et al., 2009, 2013; Fibach-Paldi et al., 2011; Helman et al., 2011). Достаточно давно известна способность азоспирилл и к существованию в организме человека (Cohen et al., 2004). Геномом азоспирилп, как и многих других альфапротеобактерии, большого размера (до 8 миллионов пар нуклеотидов), состоит из одной или более хромосом и многочисленных плазмид. Это достаточно пластичная структура, что позволяет этим микроорганизмам свободно существовать в разнообразных экологических условиях (Martm-Didonet et al., 2000; Кацы, 20026; Петрова с соавт., 2005а; Kaneko et al., 2010; Katsy, 2011; Wisniewski-Dye et al., 2011). С использованием разнообразных экспериментальных подходов наиболее хорошо изучены штаммы A. brasilense Sp7 (типовой) и Sp245 (факультативный эндофит, привлекающий особое внимание в связи со способностью к проникновению в корни пшеницы). Недавно были опубликованы данные о почти полной нуклеотидной последовательности хромосомы и шести плазмид (из семи известных) A. brasilense Sp245 (Wisniewski-Dye et al., 2011) и ряда других штаммов азоспирилл. Однако значительная часть предсказанных генов азоспирилл не имеет

EDTA Na2 - 0.037 (pH 6.0).
2.4 Инсерционный мутагенез бактерий
Омегоновый мутагенез азоспирилл осуществляли посредством скрещивания штамма A. brasilense Sp245 с донорным штаммом E. coli S17-1, несущим вектор pJFF350, как это было описано ранее (Scheludko et al., 1998; Katzy et al., 1998). Культуры штаммов донора и реципиента выращивали до поздней логарифмической фазы. Культуру E. coli перед скрещиванием “омолаживали”, разводя её стерильной средой в 10 раз и подращивая в течение 3-х часов. Культуры донора и реципиента смешивали в пробирках типа эппендорф в соотношении донор:реципиент, равном 1:5, осаждали клетки центрифугированием (1 мин при 10 тыс. g), сливали надосадочную жидкость, осадок осторожно ресуспендировали в оставшейся капле (20-30 мкл) супернатанта и наносили одной каплей на поверхность хорошо подсушенной плотной MSM в чашке Петри. Смесь инкубировали 18 ч при 32°С. Контролем служили культуры донора и реципиента, которые подвергали аналогичной процедуре. По окончании скрещивания коньюгационную смесь, культуры донора и реципиента смывали с поверхности среды 1 мл стерильной дистиллированной воды и высевали по 100 мкл серийных десятикратных разведений полученных суспензий на соответствующие селективные среды.
Частоту возникновения трансконъюгантов выражали в виде отношения их количества к количеству клеток реципиента в коньюгационной смеси. Выросшие через двое-трое суток после рассева коньюгационной смеси трансконъюганты подвергали многократной расчистке рассевом штрихом до отдельных колоний на селективной среде с канамицином.
2.5 Анализ плазмидного состава бактерий. Препаративное выделение плазмидной и тотальной ДНК. Клонирование ДНК
Визуализацию плазмидной ДНК в аналитических гель-электрофорезах проводили по (Eckhardt, 1978). Препаративное выделение плазмид и тотальной ДНК,