Генетические детерминанты специфических секретируемых ингибиторов лизоцима в антилизоцимной активности энтеробактерий

• Автор: Андрющенко, Сергей Валерьевич
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Оренбург
• Количество страниц: 95 с. : 19 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЛИЗОЦИМ-РЕЗИСТЕНТНОСТИ И АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Неспецифические механизмы лизоцимрезистентности бактерий

1.1.1. Экранирование пептидогликана

1.1.2. Модификация пептидогликана

1.1.3. Секреция неспецифических ингибиторов

1.2. Специфические ингибиторы лизоцима белковой природы

1.2.1. Анионный термостабильный ингибитор

1.2.2. Ингибитор лизоцима позвоночных

1.2.3. Периплазматический и мембраносвязанный
ингибиторы лизоцима
1.3. Регуляция продукции специфических ингибиторов лизоцима
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в работе
2.2. Методы исследования профиля генетических детерминант ингибиторов лизоцима у исследуемых энтеробактерий
2.2.1. Методы и средства, использованные для филогенетического анализа и конструирования специфичных праймеров генетических детерминант ингибиторов лизоцима
2.2.2. Метод ПЦР-скрининга генетических детерминант ингибиторов лизоцима
2.2.3. Методики анализа плазмидной ДНК
2.3. Методы изучения ряда биологических свойств энтеробактерий

2.3.1. Определение профиля антибиотикорезистентности
2.3.2. Метод выявления лизоцимрезистентности энтеробактерий
2.3.3. Определение уровня антилизоцимной активности
2.3.3.1. Чашечный метод 3
2.3.3.2. Фотометрический метод
2.3.3.3. Метод определения сорбционного компонента АЛА
2.4. Способы регуляции антилизоцимной активности бактерий
2.4.1. Методы стимуляции антилизоцимной активности
2.4.2. Методы ингибирования антилизоцимной активности
2.5. Методы статистической обработки полученных результатов
ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ СЕКРЕТИРУЕМЫХ ИНГИБИТОРОВ ЛИЗОЦИМА ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
3.1. Анализ последовательностей гомологов генов секретируемых ингибиторов лизоцима
3.2. Филогенетический анализ генов рНС и /ууС энтеробактерий
3.3. Конструирование ПЦР тест-систем для выявления генов секретируемых ингибиторов лизоцима
3.4. Анализ распространенности генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима
3.5. Анализ плазмидного профиля исследуемых штаммов энтеробактерий
ГЛАВА 4. ЛИЗОЦИМРЕЗИСТЕНТНОСТЬ И АНТИЛИЗО-ЦИМНАЯ АКТИВНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
4.1. Общая антилизоцимная активность энтеробактерий,
(чашечный метод)

4.2. Характеристика экскретируемого компонента антилизоцим-
ной активности энтеробактерий (фотометрический метод)
4.3. Характеристика сорбционного компонента антилизоцимной активности энтеробактерий, (фотометрический метод)
4.4. Скрининг лизоцимрезистентности эптеробактерий
в комбинированной среде
ГЛАВА 5. РЕГУЛЯЦИЯ АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ С РАЗЛИЧНЫМ ГЕНЕТИЧЕСКИМ ПРОФИЛЕМ
5.1. Изменение антилизоцимной активности и копийности пДНК у штаммов Е. сой, отличающихся по плазмидному профилю под действием хлорамфеникола
5.2. Изменение антилизоцимной активности и копийности пДНК у штаммов Е. сой, отличающихся по плазмидному профилю под действием акридоновых соединений
5.3. Изменение антилизоцимной активности у энтсробактерий, отличающихся по присутствию рйС-мегаплазмид под действием хлорамфеникола и акридинового оранжевого
5.4. Влияние пептидогликанового стресса на уровень антилизоцимной активности
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

комбинированной среде на основе бессолевого LB-бульона с добавлением 8, 10 или 12тМ трилона Б, использованного для повышения проницаемости наружной мембраны грам-отрицательных бактерий в отношении лизо-цима (Deckers D. et al., 2004), оценивая результат по наличию либо отсутствию роста микроорганизмов аналогично вышеуказанной методике определения устойчивости к низкомолекулярным антибиотикам.
2.3.3. Определение уровня антилизоцимной активности. У всех исследуемых штаммов был определен уровень секретируемого компонента антилизоцимной активности чашечным и фотометрическим методом по
О.В. Бухарину с соавт. (1999).
Сорбционный компонент данного признака выявлялся по методу
В.Ю. Соколова и А.П. Луда в модификации (Черкасов С.В., 2011). Конечная концентрация раствора лизоцима для обоих методов составила 5 мкг/мл.
2.З.З.1. Чашечный метод. Для осуществления методики готовили ряд чашек Петри с ГРМ-агаром, содержащим лизоцим в концентрациях от 0 до 6 мкг/мл с шагом 1 мкг/мл. Для этого к 9 мл тёплого 1,5% ГРМ-агара для культивирования микроорганизмов (НПО "Питательные среды", г. Махачкала) добавляли 1 мл раствора лизоцима куриного яичного белка («Sigma», Канада) в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия.
Тщательно высушивали открытые перевёрнутые чашки Петри в течение 1 ч при 37°С. На поверхность приготовленных сред "пятачками" засевали исследуемые суточные агаровые культуры микроорганизмов.
После инкубации в термостате в течение 24 ч при 37 С выросшие колонии убивали парами хлороформа. Для этого держа чашки перевёрнутыми, вкладывали в их крышки кусочки фильтровальной бумаги ватман площадью 4-5 см2 и пропитывали их 0,5 мл хлороформа и инкубировали при 37 С в течение 45 мин. После чего на поверхность 1,5% агара с коло-