Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов

• Автор: Мазепа, Владимир Николаевич
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Нижний Новгород
• Количество страниц: 310 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Оглавление

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Современные молекулярно-биологические методы диагностики инфекционных заболеваний

1.1.1. Молекулярное зондирование

1.1.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

1.1.3. Сложности, возникающие при использовании ПЦР

в практической диагностике

1.2. Современная лабораторная диагностика ряда актуальных бактериальных и вирусных инфекций
1.2.1. Диагностика бактериальных ОКИ
1.2.2. Диагностика хеликобактерной инфекции
1.2.3. Диагностика парентеральных вирусных гепатитов
1.2.4. Диагностика НУГИ
1.3. Внедрение и использование ПЦР в практическом здравоохранении Российской Федерации
2. Собственные исследования
2.1. Материалы и методы
2.1.1. Материалы
2.1.2. Методы
2.2. Результаты собственных исследований
2.2.1. Формирование материальной базы для проведения исследований
2.2.1.1. Выбор приборов для проведения ПЦР
и фиксирования результатов
2.2.1.2. Сравнение вариантов выделения нуклеиновых кислот
из клинического материала
2.2.1.3. Разработка ПЦР тест-систем для выявления генов факторов патогенности Еп1егоЬас1епасеае
2.2.1.4. Разработка ПЦР тест-системы для экспресс-детекции
шигелл и энтероинвазивных эшерихий
2.2.1.5. Адаптация отечественных ПЦР тест-систем для выявления бактерий рода Salmonella к практическим исследованиям
2.2.1.6. Адаптация ПИР тест-системы для выявления
генов токсина и адгезинов V.cholerae
2.2.1.7. Адаптация ПЦР тест-систем для выявления H.pylori
2.2.1.8. Разработка полуколичественного варианта ПЦР детекции
H.pylori для контроля эффективности антихеликобактерной терапии
2.2.1.9. Адаптация ПЦР тест-системы для выявления гена вакуолизирующего цитотоксина H.pylori VacA
2.2.1.10. Выбор и адаптация ППД тест систем для выявления возбудителей вирусных гепатитов и НУГИ
2.2.1.11. Разработка полуколичественного варианта ПЦР
для детекции ВГВ и ВГС
2.2.2. Значимые направления использования молекулярно-биологических методов в диагностике бактериальных ОКИ
2.2.2.1. Изучение распространенности генов факторов патогенности бактериальных возбудителей ОКИ с использованием молекулярнобиологических методов
2.2.2.2. Использование ПЦР тест-систем для детекции бактерий родов Shigella и Salmonella в санитарно-эпидемиологической и клинической практике
2.2.2.3. Изучение эффективности панели отечественных ПЦР тест систем для выявления наиболее значимых бактериальных возбудителей ОКИ в Нижегородском регионе

2.2.2.4. Алгоритм использования метода ПЦР в диагностике бактериальных

2.2.3. ПЦР в диагностике хеликобактерной инфекции
и изучении ее возбудителя
2.2.3.1. Выявление H.pylori в различных типах
клинического материала
2.2.3.2. Сравнительный анализ результатов детекции Н. pylori, полученных
традиционными и молекулярно-биологическими методами
2.2.3.3 Изучение распространенности H.pylori у больных с различными формами гастродуоденальной патологии
2.2.3.4. Использование полуколичественного варианта ПЦР-детекции
H.pylori для оценки эффективности антихеликобактерной терапии
2.2.3.5 Использование ПЦР для определения резистентности H.pylori к атибиотикам-макролидам
2.2.3.6. Изучение возможности использования метода ПЦР для выявления факторов патогенности H.pylori
2.2.3.7. Изучение гетерогенности нуклеотидных последовательностей фрагментов гена CagA H.pylori методом гетеродуплексного анализа
2.2.3.8. Разработка алгоритма обследования больных с гастродуоденальной патологией на инфицированность H.pylori методом ПЦР
2.2.4. Возможные направления использования ПЦР в диагностике парентеральных вирусных гепатитов
2.2.4.1.Сопоставление результатов диагностики ВГ В и ВГС, полученных методами ПЦР и ИФА
2.2.4.2. Активность вирусов при хронических ВГВ и ВГС, возрастные особенности хронических гепатитов В и С, репликация вирусных НК при гепатитах смешанной этиологии
2.2.4.3. Изучение распространения ВГС ведущих генотипов в Нижегородском регионе

Н.ру1оп - мелкие, неспорообразующие, грамотрицательные, оксидазо-и каталазо-положительные, продуцирующие большое количество уреазы, микроаэрофильные бактерии изогнутой, 8-образной или слегка спиральной формы. Толщина клетки бактерии 0,5—1,0 мкм, длина 2,5—3,5 мкм. Клетка покрыта гладкой оболочкой, на одном из полюсов имеет 1—6 мономерных жгутиков длиной 5-10 мкм. [12, 86]
Геном Н.руЬп невелик - 1600 генов [352]. Содержание гуанина и цитозина в ДНК - 35-37 мол %. По этому признаку он дифференцируется от кампилобактеров. В их ДНК % ГЦ оснований составляет 31-32 [86].
Существующие в настоящее время методы диагностики хеликобактерной инфекции могут быть разделены на две группы -инвазивные и неипвазивные. Инвазивные методы предусматривают проведение эндоскопического исследования с отбором биопсийного материала [144]. Следует отметить, что методики, базирующиеся на эзофагогастродуоденоскопии, подвержены случайностям из-за неравномерного распределения клеток Н.ру1оп по гастродуоденальной слизистой. Для предотвращения ложноотрицательных результатов используют множественную биопсию. При этом соскобы делают не только в антральном отделе, но и в теле желудка. Рекомендуется брать биоптаты в 5-7 участках. [231]
К неинвазивным методам диагностики хеликобактериоза относятся иммунологические исследования, позволяющие определять наличие антител в сыворотке крови, а также уреазные дыхательные тесты и «аэротест» [111]. По поводу неинвазивности иммунологических методов можно дискутировать, так как для них необходим отбор крови. Эти методы используются, главным образом, в эпидемиологических исследованиях с целью изучения распространения инфекции, ассоциированной с Н.ру1оп.
Бактериологический метод.