Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к сублетальному действию антибиотиков

• Автор: Ахова, Анна Викторовна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пермь
• Количество страниц: 144 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Список сокращений

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Роль полиаминов в жизнедеятельности микроорганизмов

1.1.1. Биогенные полиамины и пути регуляции их внутриклеточной концентрации

1.1.2. Физиологическая роль полиаминов

1.1.3. Роль полиаминов в адаптации к стрессу

1.2. Механизмы антибактериального действия основных групп бактерицидных антибиотиков

1.2.1. ß-лактамы

1.2.2. Аминогликознды
1.2.3. Хинолоны
1.2.4. Окислительное повреждение как неспецифический механизм действия антибиотиков разных групп
1.2.4.1. Механизмы образования активных форм кислорода и их токсическое
действие на основные компоненты клетки
1.2 4 2. Развитие эндогенного окислительного стресса под действием
разнообразных стрессовых факторов
1.2.4.3. Формирование окислительного стресса в условиях воздействия антибиотиков разных групп
1.3. Механизмы устойчивости бактерий к антибиотикам
1.3.1. Механизмы специфической устойчивости
1.3.1.1. Модификация мишени действия
1.3.1.2. Ферментативная инактивация антибиотика
1.3.2. Механизмы неспецифической устойчивости, основанные на функционировании систем адаптации к различным видам стресса
1.3.2.1. Механизмы мноэ/сествениой лекарственной устойчивости, основанные на ограничении поступления ксенобиотиков в клетку
1.3.2.2. Активный выброс ксенобиотиков из клетки. Многоцелевые системы выброса
1.3.2.3. RpoS - глобальный транскрипционный регулятор общего стрессового ответа
1.3.2.4. MarA/SoxS/Rob — транскрипционные регуляторы множественной антибиотторезистентпости
1.3.2.5. Влияние полиаминов на устойчивость бактерий к атпибиотика-м
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования
2.2. Культивирование микроорганизмов :
2.3. Определение активности ß-галактозидазы
2.4. Определение содержания полиаминов в клетке
2.5. Определение активности ферментов синтеза полиаминов
2.6. Определение концентрации белка
2.7. Определение содержания адениловых нуклеотидов в клетках
2.8. Подсчет числа живых клеток
2.9. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
2.10. Определение содержания активных форм кислорода в клетках
2.11. Транспортная активность пориновых каналов
2.12. Оценка повреждения ДНК при действии антибиотиков
2.13. Статистическая обработка
РЕЗУЛЬТАТЫ
ГЛАВА 3. Полиамины как фактор устойчивости Е coli к антибиотикам
3.1. Влияние антибиотиков на активность системы синтеза полиаминов
3.2. Участие транскрипционных регуляторов SoxS и RpoS в регуляции активности лизиндекарбоксилаз
3.3. Влияние полиаминов на устойчивость E. coli к антибиотикам
3.3.1. Эффект естественного содержания эндогенных полиаминов на степень устойчивости Е coli к антибиотикам
3.3.2. Влияние экзогенных полиаминов на устойчивость Е coli к антибиотикам
ГЛАВА 4. Роль полиаминов в адаптации E. coli к окислительному стрессу, вызванному действием антибиотиков
4.1. Развитие окислительного стресса как следствие разобщения обменных процессов в результате сублетального действия антибиотиков
4.1.1. Антибиотики разных классов вызывают усиление продукции активных форм кислорода в клетках E. coli
4.1.2. Изменение энергетического состояния клеток E. coli в условиях сублетального действия антибиотиков
4.2. Роль антиоксидантных свойств полиаминов в адаптации Е coli к действию антибиотиков
4.3. Сравнение антиоксидантных свойств полиаминов и тиомочевины в условиях действия антибиотиков
ГЛАВА 5. Роль полиаминов в защите ДНК от повреждающего воздействия антибиотиков

5.1. Сублетальное действие антибиотиков вызывает фрагментацию бактериальной ДНК

5.2. Роль полиаминов в защите ДНК от разрывов, индуцированных сублетальным действием антибиотиков
5.3. Сравнение ДНК-защитных свойств полиаминов и тиомочевины в условиях действия антибиотиков
ГЛАВА 6. Ограничение проницаемости внешней мембраны Е coli как механизм защиты
от действия антибиотиков
ГЛАВА 7. Обсуждение результатов
7.1. Роль полиаминов в формировании адаптивного ответа E. сок на действие различных групп антибиотиков
7.2. Антиоксидантное действие полиаминов при адаптации E. coli к воздействию антибиотиков
7.3. Влияние полиаминов на окислительное повреждение бактериальной ДНК, вызванное воздействием антибиотиков разных классов
7.4. Роль полиаминов в ограничении проницаемости внешней мембраны E. coli для ■ антибиотиков
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Распространение патогенных микроорганизмов, обладающих устойчивостью к антибиотикам, в последнее время происходит в широких масштабах и с высокой скоростью (Drlica, Malik, 2003; Yamane et al., 2005; Kong et al., 2009). Знание механизмов, лежащих в основе антибиотикорезистентности, могло бы способствовать ее успешному преодолению, и, следовательно, повышению эффективности антибактериальной терапии.
Комплексное воздействие факторов внешней среды на микроорганизмы в местах естественного обитания способствовало формированию у них универсальных механизмов защиты, обеспечивающих выживание в разнообразных стрессовых ситуациях. Функциональные возможности данных систем адаптации к различным неблагоприятным факторам среды могут быть направлены, среди прочего, на противодействие антибиотикам и являться основой формирования неспецифических механизмов антибиотикорезистентности. Среди таких неспецифических адаптивных механизмов выделяют ограничение проникновения антибиотиков в клетку, а также их активное выведение из клетки посредством работы помп множественного лекарственного выброса (Сидоренко, Тишков, 2004).
В последнее время появляются сообщения о вовлеченности активных форм кислорода (АФК) в антибактериальное действие разных групп антибиотиков (Albesa et al. 2004; Kohanski et al., 2007). Поскольку действие антибиотиков сопровождается окислительным повреждением бактериальной клетки, функционирование систем антиоксидантной защиты могло бы вносить вклад в снижение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.
В качестве неспецифических адаптогенов, принимающих участие в процессе приспособления разнообразных организмов (от бактерий до растений и млекопитающих) к неблагоприятным условиям среды, все чаще рассматривают полиамины (Rhee et al., 2007; Kusano et al., 2008). Биогенные
RpoS. Данный белок представляет собой альтернативную (os) субъединицу РНК-полпмеразы и регулирует экспрессию более чем 100 генов E. coli (Patten et al., 2004). Под контролем RpoS находятся как специфичные системы адаптации к определенным видам стрессов (осмотическому, кислотному, температурному и др.) (Hengge-Aronis, Loewen, 1994; Hengge-Aronis,. 2002), : так и общие защитные механизмы, такие как ферменты системы,репарации и белки-шапероны (Demple, Halbrook, 1983; Matin, 1991; Merrikh et al., 2009). Благ одаря тому, чго гены разных адаптивных ответов объединены .общим транскрипционным регулятором, наблюдается явление множественной, стрессовой устойчивости микроорганизмов.
Регуляция содержания RpoS в клетке может' происходить за счет изменения количества rpoS мРНК, скорости ее трансляции и замедления распада белка RpoS. В регуляцию содержания RpoS в клетке вовлечены" разнообразные по своей, природе факторы: малые регуляторные молекулы (гуанозинтетрафосфат, ц-АМФ, полиамины), малые нетранслируемые РНК, (dsrA, oxyS), специфические сенсор-регуляторные пары (RssB, ВагА), изменение комбинации ДНК-связывающих белков (Hengge-Aronis, 2002).
Как известно, антибиотикоустойчивость микроорганизмов значительно повышается при переходе культуры к стационарной фазе роста. О вовлеченности RpoS в адаптивный ответ клеток на действие, антибиотиков может свидетельствовать снижение лекарственной устойчивости мутантов, лишённых фоб' (Greenway, England, 1999). Кромё того, было показано, что в условиях стрессовых воздействий, приводящих к повышению экспрессии rpoS, ' наблюдается значительное (вплоть до перехода штамма в категорию устойчивых) повышение минимальной подавляющей концентрации фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков (Ткаченко и др., 2006).
1.3.2.4... MarA/SoxS/Rob — транскрипционные регуляторы множественной антибиотикорезистентности
Значительная степень гомологии регуляторных последовательностей у таких транскрипционных регуляторов как MarA, SoxS, Rob обусловливает