Фенотипический и молекулярно-генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эльтор

• Автор: Шашкова, Алена Владимировна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 131 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фенотипические и генетические особенности измененных вирулентных вариантов V. ско1егае биовара эльтор
1.1.1 Фенотипические особенности вирулентных геновариантов V ско!егае биовара эльтор
1.1.2 Генетические особенности строения профага СТХф измененных вирулентных вариантов V. ско1егае биовара эльтор

1.1.3 Генетические особенности структуры локусов хромосомы измененных вариантов V. скоіегае биовара эльтор, связанных с вирулентностью и пандемичностью

1.2. Механизмы возникновения измененных вариантов холерных

эльтор вибрионов СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Питательные среды и реактивы
2.3. Методы
2.3.1 Культивирование штаммов
2.3.2 Определение питательных потребностей, гемолитической активности, продукции растворимой гемагглютинин/протеазы
фосфолипазы и подвижности
2.3.3 Изучение продукции холерного токсина и токсин-

корегулируемых пилей адгезии

2.3.4 Определение чувствительности к антибактериальным препаратам
2.3.5 Изучение вирулентности и токсигенности штаммов V. ско1егае
ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ И АПРОБАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE 01 КЛАССИЧЕСКОГО И ЭЛЬТОР БИОВАРОВ, ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЭЛЬТОР ВИБРИОНОВ НА ТИПИЧНЫЕ И ИЗМЕНЕННЫЕ МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1. Выбор ДНК-мишеней, подбор праймеров
3.2. Оптимизация параметров мультиплексной ПЦР
3.3. Оптимизация схемы пробоподготовки и разработка набора реагентов для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae 01 классического и эльтор биоваров и дифференциации эльтор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом

результатов
3.4. Изучение специфичности созданной мультиплексной ПЦР тест-системы «Ген Vibrio cholerae вариант cfccb-РЭФ»
3.5. Выявление генетически измененных вариантов возбудителя холеры среди клинических штаммов, выделенных на территории России и стран ближнего зарубежья, с помощью разработанного набора
2.3.6 ПЦР-анализ
2.3.7 ДНК-ДНК гибридизация по Саузерну
2.3.8 Секвенирование

ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНЫМ ФЕНОТИПИЧЕСКИМ АНАЛИЗ ВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ V СНОЬЕЯАЕ БИОВАРА ЭЛЬТОР
4.1. Продукция холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии у типичных и измененных клинических штаммов V. ско1егае биовара эльтор
4.2. Питательные потребности, гемолитическая, ферментативная активность и подвижность типичных штаммов и измененных вариантов V ско1егае
4.3. Антибиотикоустойчивость типичных штаммов и измененных вариантов холерных вибрионов биовара эльтор
ГЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕННЫХ ВАРИАНТОВ V СНОЬЕКАЕ БИОВАРА ЭЛЬТОР
5.1. Изучение структуры генома профага СТХср измененных вариантов V. ско1егае биовара эльтор
5.1.1 Определение аллелей генов МхВ и п!/?
5.1.2 Определение числа копий профага СТХф у измененных вариантов
5.1.3 Структура промоторной области оперона с1хАВ
5.2. Анализ структуры островов патогенности УР1-1 и УР1-2 у измененных вариантов V. ско1егае биовара эльтор методом ПЦР-анализа и секвенирования
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

При этом латеральный перенос профага CTX(pclass мог произойти как в водной среде, так и в организме хозяина (Safa A. et al., 2010).
Возможно, что профаг СТХср классического типа мог быть получен эльтор вибрионами и от представителей рода Vibrio. Установлено, что холерные вибрионы не01/не0139 серогрупп и Vibrio mimicus могут содержать в своем геноме профаг СТХф классического типа. Его наличие, например, выявлено в штаммах V. cholerae 0141 серогруппы (Dalsgaard A. et al., 2001). В 1998 г. S.M. Faruque с соавт. показали, что фаг СТХф может инфицировать природные нетоксигенные штаммы холерных вибрионов, содержащие в своем геноме кластер генов ТКПА. При этом было высказано предположение, что процесс переноса СТХф в природных условиях может служить основным путем образования токсигенных штаммов из нетоксигенных. В то же время ни классические холерные вибрионы, ни вибрионы 0141 серогруппы не способны продуцировать фаг СТХф0“5 во внешнюю среду, что ставит под сомнение приобретение вибрионами биовара эльтор профага СТХфС1а5В путем фаговой конверсии (Смирнова Н.И. с соавт., 2010; Udden S.M.N. et al., 2008).
Однако K.L. Meibom с соавт. (2005) экспериментально доказали возможность приобретения генетического материала в результате трансформации при нахождении холерных вибрионов в составе биопленки на хитиновой поверхности. Учитывая, что хитин является составной частью скелета членистоногих, служащих основным материалом для прикрепления при формировании холерным вибрионом биопленки во внешней среде, данный путь передачи генетического материала является важным фактором эволюции V cholerae. Позднее М. Blokesch с соавт. (2007) получили в результате хитин-индуцированной трансформации штаммы V. cholerae 0139 и 037 серогрупп из V. cholerae 01 серогруппы. В экспериментах S.M.N. Udden с соавт. (2008) была доказана возможность трансформации классического профага СТХф из штаммов V. cholerae 0141 серогруппы в геном эльтор вибрионов при их совместном инкубировании в речной воде в присутствии хитинового субстрата