Эффективность дифференциальной диагностики ОРВИ методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени

• Автор: Лободанов, Сергей Александрович
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Классификация и общая характеристика респираторных вирусов
1Л. 1 РНК-содержащие вирусы - возбудители ОРВИ
1.1.2 ДНК-содержащие вирусы
1.1.3 Другие вирусы, ассоциированные с респираторными симптомами
1.2 Роль вирусов в этиологии респираторных заболеваний человека
1.2.1 Тяжелые респираторные заболевания вирусной этиологи
1.2.2 "Простудные" заболевания
1.2.3 Респираторные вирусы как пусковой механизм бронхиальной астмы
1.3 Методы молекулярной диагностики респираторных вирусных инфекций
1.3.1 Полимеразная цепная реакция и ее модификации
1.3.2 Методы изотермической амплификации нуклеиновых кислот
1.3.3 Технологии, основанные на молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот
1.3.4 Системы внешнего и внутреннего контроля качества молекулярной диагностики
1.3.5 Показатели диагностической ценности наборов реагентов
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы
2.1.1 Лабораторные штаммы вирусов
2.1.2 Панели клинических образцов
2.1.3 Клеточные линии
2.1.4 Химические реактивы
2.1.5 Наборы реагентов для выявления респираторных вирусов методом ПЦР-РВ
2.2 Методы
2.2.1 Изоляция и идентификация вирусов гриппа в клетках культуры тканей

2.2.2 Анализ нуклеотидных последовательностей in silico
2.2.3 Получение мазков из полости носа для исследования методом ПЦР
2.2.4 Выделение вирусных нуклеиновых кислот
2.2.5 Реакция обратной транскрипции
2.2.6 ПЦР-РВ с флуоресцентной детекцией в модификации TaqMan
2.2.7 Г ель-электрофорез ДНК
2.2.8 Клонирование ПЦР-продуктов в плазмиде и секвенирование фрагментов геномов вирусов
2.2.9 Получение фрагментов геномов РНК-содержащих вирусов в реакции транскрипции
2.2.10 Статистическая обработка результатов исследований
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДЕДОВ АНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Оптимизация условий выявления 12 групп респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ)
3.1.1 Подбор праймеров и зондов для дифференциального выявления респираторных вирусов методом ПЦР-РВ
3.1.2 Оптимизация условий и формата постановки мультиплексной реакции обратной транскрипции и ПЦР-РВ
3.1.3 Приготовление пулов контрольных образцов и контрольных образцов чувствительности для набора реагентов
3.1.4 Апробация набора реагентов для прибора Rotor-Gene 6
3.2 Определение диагностической ценности метода мультиплексной ПЦР-РВ для расшифровки случаев ОРВИ
3.2.1 ПЦР-анализ панелей клинических образцов, в том числе охарактеризованных в культуре клеток MDCK на наличие вирусов гриппа А и гриппа В
3.2.2 Участие в международной программе контроля качества молекулярной диагностики
3.2.3 Определение показателей диагностической ценности мультиплексной ПЦР-РВ: диагностической чувствительности, специфичности, воспроизводимости
3.3 Исследование видовой структуры риновирусов и коронавирусов, циркулирующих в Московском регионе
3.3.1 Отработка условий дифференциального выявления разных видов риновирусов и коронавирусов
3.3.2 Изучение видового разнообразия риновирусов и коронавирусов, циркулирующих в Московском регионе
3.3.3 Оценка роли риновирусов и коронавирусов в этиологии ОРВИ различной степени тяжести
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

непосредственного влияния на бронхолегочную реактивность, а с другой стороны, рассматриваются возможности влияния вирусной инфекции на раннее формирование аллергической реактивности вследствие усиления сенсибилизации к ингалируемым аллергенам [5].
Так как в формировании БА вовлечены различные звенья иммунной системы, исследовательские группы обычно сосредотачивают свои изыскания на изучении изменений в отельных звеньях систем врожденного и приобретенного иммунитета, приводящих к формированию Б А и ее последующих обострений. Так, например, Bochkov Y.A. с соавторами отмечают, что РВ инфекция может модулировать (как понижать, так и повышать) экспрессию множества генов, ответственных за иммунный ответ и ремоделирование дыхательных путей, в эпителиальных клетках бронхиального дерева у больных Б А легкой степени тяжести [69]. Исследования Message S.D. с коллегами показали, что при экспериментальной риновирусной инфекции у больных с БА развивались значительно более серьезные респираторные симптомы, а также повышенная гиперреактивность бронхов по сравнению со здоровыми добровольцами, вследствии подавления Th 1-ответа, и особенно дефицита такого важного регуляторного цитокина как интерлейкин-10, а также недостатка интерферрона-у. Продукция таких Th-2 зависимых интерлейкинов как IL-4, IL-5 и IL-13 была повышена у лиц с Б А [196].
При вирусной инфекции респираторного тракта клетками эпителия продуцируется широкий спектр медиаторов, включая IL-1, IL-6, IL-8 и IL-11, INF-ß, INF-/., а также TNFa, GM-CSF и различные хемокины [213]. Все эти медиаторы являются патогенетическими факторами, опосредующими развитие и прогрессирование ремоделирования дыхательных путей, а также формирования астматического фенотипа. Kawayama Т. с соавторами указывают на провоспалительный IL-18 (являщийся индуктором INF-y) как на основной фактор в патогенезе воспалительных заболеваний легких, включая БА и ХОБЛ [154].
Одним из самых авторитетных обществ, изучающих БА и другие аллергические заболевания, является Глобальная Европейская Сеть по Аллергии и Астме (Global Allergy and Asthma European Network, GA2LEN). В 2007 г. эксперты Европейского респираторного общества опубликовали обширный обзор, имеющий статус документа GA2LEN, посвященный механизмам вирусиндуцированной астмы