Биологические свойства вируса гриппа свиней типа A и усовершенствование методов серологической диагностики

• Автор: Ремыга, Степан Геннадьевич
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 143 с. : ил.

Оглавление
1..............................................................ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Классификация вируса гриппа
2.2 Морфологический и химический состав вируса гриппа свиней и устойчивость к физико-химическим факторам
2.3 Репликация вируса
2.4 Патогенез
2.5 Клинические признаки
2.6 Патологоанатомические и гистологические изменения
2.7 Клинико-эпизоотологическая характеристика гриппа свиней
2.8 Иммунитет и профилактика заболевания
2.9 Диагностика
2.9.1. Серологическая диагностика
2.9.2 Реакция нейтрализации
2.9.3 Иммуноферментный анализ
2.9.4 Полимеразная цепная реакция
2.9.5 Заключение по обзору литературы
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Материалы
3.1.2. Вирусы
3.1.3. Эмбрионы кур
3.1.4 Культуры клеток
~~371757 Животные... .7.7
3.1.10. Получение нормальной сыворотки крови животных
3.1.11. Получение специфической к типу А подтипа Н1N1 сыворотки крови животных
3.1.12. Получение специфической к типу А подтипа НЗИ2 сыворотки крови
животных
3.1.13 Получение эритроцитов животных
3.1.14. Подготовка сывороток крови свиней и кроликов к исследованиям
3.1.15. Химреактивы и растворы
3.1.15.1 Приготовление поддерживающей питательные среды
3.1.15.2 Приготовление физиологического раствора
3.1.15.3 Приготовление консерванта Мигулиной
3.1.15.4 Приготовление раствора цитрата натрия
3.1.16. Оборудование
3.2. Методы исследования
3.2.1. Культивирование ВГС типа А подтипа H1N1 на куриных СПФ эмбрионах
3.2.2. Получение ВГС А подтипа H3N2 на куриных СПФ эмбрионах
3.2.3 Получение вируса гриппа свиней типа А подтипа H1N1 на перевиваемой культуре клеток MDCK
3.2.4. Получение ВГС типа А подтипа H3N2 на перевиваемой культуре клеток MDCK
3.2.5. Определение стерильности матровой расплодки ВГС
3.2.6. Молекулярно-генетические методы исследований
3.2.7. Определение инфекционной активности ВГС
3.2.8. Экспериментальное заражение лабораторных животных ВГС типа А подтипа H3N
3.2.9. Определение гемагглютинирующей активности ВГС типа А
3.2.10. Инактивация ВГС типа А
3.2.11. Очистка и концентрирование вируса гриппа свиней типа А
~ 3.2.12. Лйофйлизация 'антигена й сывороток
3.2.13. Определение титра антител к ВГС типа А в реакции торможения гемагглютинации
3.2.14. Интерпретация результатов РТГА
3.2.15. Постановка реакции микронейтрализации (РМН) для выявления антител к ВГС типа А подтипа Hl N1 в сыворотках крови свиней
3.2.16. Постановка ИФА для выявления антител к ВГС типа А подтипа H1N1 и

3.2.17. Статистическая обработка результатов исследований
4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Оценка серологических исследований по гриппу свиней типа А подтипа H1N1, проведенного в 2009-2
4.2. Разработка набора для определения уровня антител к ВГС типа А подтипа H1N1 в реакции торможения гемагглютинации
4.3. Подбор эритроцитов крови при определении гемагглютинирующей активности ВГС типа А подтипа H1N
4.4. Получение эмбрионального препарата антигена ВГС типа А подтипа H1N1 для использования в серологических реакциях
4.4.1. Культивирование ВГС типа А подтипа НINI в куриных эмбрионах
4.5. Получение культурального ВГС типа А подтипа H1N1 для использования в серологических реакциях
4.5.1. Культивирование ВГС в перевиваемой культуре клеток
4.6. Инактивация ВГС А подтипа H1N
4.6.1. Получение лиофильно высушенного инактивированного антигена ВГС типа А подтипа Н1N
4.7. Оптимизация параметров обработки нативных сывороток перед использованием их в РТГА
4.8. Получение лиофильно высушенной положительной вирусспецифической и нормальной сывороток крови свиней
4.9. Разработка реакции торможения гемагглютинации для выявления антител к вирусу гриппа свиней типа А подтипа H3N
4.9.1. Подбор эритроцитов крови при постановки РГА и РТГА
4.9.2 Изучение биологических свойств изолята вируса гриппа свиней
«А/свинья/Владимирское/2010/H3N2»
4.9.2.1 Получение эмбрионального препарата антигена ВГС типа А подтипа H3N2 для использования в серологических реакциях
4.9.2.2. Культивирование ВГС типа А подтипа H3N2 в куриных эмбрионах
В последнее время существует ряд коммерческих наборов иммуноферментного анализа (ИФА) для исследования в больших количествах сывороток крови свиней на наличие специфических антител к ВГС типа А.
В Европе применяют несколько коммерческих наборов ИФА: 11чЮЕ21М (Испания), ШРЯА (Испания), ГОЕХХ (США). В зависимости от производителя, они могут быть подтипоспецифичны, и выявлять антитела к ВГС подтипа НШ1, НЗШ и НШ2. В России используют как зарубежные (ГОЕХХ, США), так и отечественные (ГРИПП А-СЕРОТЕСТ, Москва) наборы ИФА.
Представленные наборы основаны на непрямом методе определения антител.
Сущность данного метода заключается в следующем: к иммобилизованным антигенам добавляют исследуемую сыворотку и после инкубации и удаления не связавшихся компонентов выявление специфических иммунокомплексов проводят с помощью меченых ферментом антивидовых антител.
Непрямой вариант является одним из самых распространенных в ИФА, так как универсальный меченый компонент дает возможность выявлять антитела к разным антигенам.
Однако при использовании коммерческих наборов, произведенных как в США, так и в Европе, может наблюдаться снижение чувствительности данного метода, поскольку существует значительная неоднородность вирусов того же подтипа, циркулирующих у свиней из-за антигенного дрейфа и вариационных линий в разных географических районах мира. Таким образом, выбор потенциальных вирусов в качестве антигенов в серологических методах исследования должен гарантировать соответствие штаммов ВГС действующему эпидемическому “вирусу в регионе] странсГили на континенте [40; 74; 144; 122].
2.9.4 Полимеразная цепная реакция
Помимо серологических реакций, для обнаружения подтипов вируса гриппа используют основные молекулярные методы. Использование методов обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), как обычной, так и ПЦР в реальном времени, эквивалентно чувствительности выделения вируса, а