Генетические основы аттенуации холодоадаптированного штамма-донора для живых гриппозных вакцин - A/Краснодар/101/35/59(H2N2)

• Автор: Терехов, Андрей Вадимович
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 92 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА Г ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л Вирус гриппа

1 Л.2 Цикл размножения вируса гриппа

1 Л.З Функции белков

1Л .4 Генетическая изменчивость вируса гриппа

1.2 Живые гриппозные вакцины

1.2 Л Инактивированные вакцины

1.2.2 Живые гриппозные вакцины
1.2.3 История вопроса
1.2.4 Холодоадаптированные вакцины
1.2.5 Классический метод получения ЖГВ
1.3 Обратная генетика
1.3.1 История вопроса
1.3.2 Создание живых гриппозных вакцин (ЖГВ)
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.1.1 Реактивы
2.1.2 Лабораторные штаммы вирусов
2.1.3 Клеточные линии и куриные эмбрионы
2.1.4 Плазмиды
2.2 Методы
2.2.1 Получение реассортантов
2.2.2 Определение инфекционного титра вирусов в ЭИД50 и накопление вирусов для последующих опытов
2.2.3 Концентрирование вирусов
2.2.4 Оценка патогенности вирусов для мышей
2.2.5 Определение защитной эффективности ХА реассортантов
2.2.6 Оценка нейровирулентности вирусов для мышей
2.2.7 Реакция задержки гемагглютинации
2.2.8 Выделение вириониой РНК
2.2.9 Получение ПЦР-продуктов для последующего секвенирования
2.2.10 Подбор праймеров для последующего секвенирования
2.2.11 Очистка ПЦР-продуктов
2.2.12 Секвенирование
2.2.13 Компьютерное обеспечение
2.2.14 Подготовка компетентных клеток
2.2.15 Вставка необходимых генов в плазмиды
2.2.16 Выделение макси количеств плазмидной ДНК
2.2.17 Трансфекция клеток плазмидами
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Изучение фенотипа реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2142) и эпидемическими штаммами
3.2 Изучение роли отдельных генов ХА штамма
А/Краснодар/101/35/59(Н2Х2) в поддержании его А, са и аК фенотипа на основе реассортантов, полученных методом обратной генетики
ГЛАВА 4.ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Изучение фенотипа реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2Х2) и эпидемическими штаммами
4.2 Изучения роли отдельных генов ХА штамма
А/Краснодар/101/35/59(Н2Ц2) в поддержании его А, са и аП фенотипа на основе реассортантов, полученных методом обратной генетики
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
Список литературы
ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
293Т - культура клеток почек человека 293Т
ак - аминокислотные остатки
БОЕ - бляшкообразующие единицы
вРНК - геномная РНК вируса
ГЛЕ - гемагглютинирующая единица
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖГВ - живая гриппозная вакцина
кРНК - +РНК, полностью комплементарная вРНК вируса гриппа
КЭ - куриные эмбрионы
мРНК - матричная РНК
нукл. - нуклеотиды
об/мин - обороты в минуту
ОТ - реакция обратной транскрипции
ОТ-ПЦР - реакция обратной транскрипции, проводимая в одной пробирке с ПЦР
ПЦР - полимеразная цепная реакция ПААГ - полиакриламидный гель
РЗГА — реакция задержки (торможения) гемагглютинации
РНК - рибонуклеиновая кислота
РНГ1 - рибонуклеопротеин
ХА - холодоадаптированный (о штамме)
ЭИД50/0,1мл - эмбриональная инфекционная доза вируса в 0,1мл ЭПР — эндоплазматический ретикулюм ЦПД - цитопатическая доза
att - attenuated (ослабленный, аттенуированный) (о фенотипе) са - cold adapted (холодоадаптированный) (о фенотипе)

оставшиеся гены от высокопатогеннго вируса (GS/GD/1/96). Результаты показали, что NS1 ген от непатогенного вируса ингибировал репликацию полученных реассортантов, в то время как замены генов РА, NP и М никак не влияли на патогенность вируса. Также реассортанты имеющие все гены от непатогенного штамма, но получившие NS1 от патогенного, сохранили способность размножаться и даже, в некоторых случаях, приводить к летальному исходу лабораторных животных. Эти результаты показали зависимость патогенности вируса гриппа otNSI гена.
1.3.2 Создание живых гриппозных вакцин (ЖГВ)
Как уже говорилось, обратная генетика является отличной базой для создания ЖГВ. В настоящее время идут попытки создать ЖГВ, которая бы не требовала необходимости ежегодного включения НА и NA генов сезонного, циркулирующего штамма. В данный момент сезонные вакцины (по большей части инактивированные) создаются благодаря реассортации вакцинного штамма гриппа (например, A/PR/8/34 (H1N1)) и циркулирующего штамма. Полученный реассортант содержит сегменты генома, кодирующие НА и NA от дикого штамма вируса, а остальные сегменты от вакцинного A/PR/8/34 (H1N1). Но классический метод создания реассортантов достаточно трудоёмкий и занимает длительное время. В противоположность методу реассортации, обратная генетика позволяет получить необходимый реассортант в короткие сроки, так как изначально можно иметь набор плазмид с генетической информацией вакцинного штамма, и необходимо будет только создать плазмиды с генами дикого штамма. Подобная ЖГВ была впервые создана на основе холодоадаптированных вирусов гриппа, используемых для создания ЖГВ в США (вакцина FluMist). Были взяты два стабильных мутанта вируса гриппа А и В, которые ранее использовали для создания вакцины методом реассортации (А/ Энн Арбор /6/60 и В/ Энн Арбор /1/66). И были взяты гены НА и NA от циркулирующего вируса [58].