Структурно-функциональный анализ N-концевой половины белка ТБГ1 гордеивируса

• Автор: Макаров, Валентин Владимирович
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. УЧАСТИЕ БЕЛКОВ ТРОЙНОГО БЛОКА ГЕНОВ В ПРОЦЕССАХ ТРАНСПОРТА ВИРУСОВ ПО РАСТЕНИЮ
Общая характеристика процесса транспорта вирусов в растениях и роли
транспортных белков
Общая характеристика вирусов рода Horcleivirus
Общая характеристика тройного блока генов
Свойства белков ТБГ1
Свойства белков ТБГ2
Свойства белков ТБГЗ
Белок-белковые взаимодействия между белками ТБГ
Внутриклеточный и межклеточный транспорт у гордеивирусов „15
II. ОСНОВНЫЕ ТИПЫ РНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ ДОМЕНОВ
OB домен (олигонуклеотид-связывакшшй домен)
КН домен (домен гомологичный белку К гяРНП)
RRM/RNP/RBD домен (мотив узнающий РНК)
Дополнительные домены, взаимодействующие с РНК ’
Нативные частично или полностью неупорядоченные белки
РНК-свпзывающие белки как РНК-шапероны
Функции клеточных РНК-связывающих доменов, участвующих в образовании
трансляционно неактивных мРНП (на примере CSD домена)
CSD белки как шапероны мРНК
CSD белки как гистоны мРНК
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКА ТБГ1 ПЛВМ :
1.1. Ограниченный протсолиз рекомбинантного белка ТБГ1 ПЛВМ в клетках Esherichia coli
1.2. Предсказание упорядоченных и неупорядоченных участков для доменов белка ТБГ1
1.3. Спектры кругового дихроизма делеционных мутантов белка ТБГ1
1.4. Изучение вторичной структуры домена ГО с помощью метода ИК-Фурье спектроскопии
2. БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДОМЕНОВ Х-КОНЦЕВОЙ ПОЛОВИНЫ БЕЛКА ТБГ1
2.1. Анализ РНК-связывающен активности 1ТИ и ГО
2.2. Анализ олигомерных комплексов, образуемых доменами белка ТБГ1, методом ультрацентрифугирования в градиентах концентрации сахарозы
3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДОМЕНОВ Х-КОНЦЕВОЙ ПОЛОВИНЫ БЕЛКА ТБГ1 ПЛВМ
3.1. Анализ поведения олигомерных комплексов доменов Х-концевой половины белка 63К методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС)
3.2. Визуализация мультимерных комплексов, образуемых Х63К, ХТ1) и ГО методом АСМ
3.3. Роль РНК в формировании высокомолекулярных комплексов в препаратах внутреннего домена
3.4. Поиск глобулярных участков в составе ГО
3.5. ХТИ и Х63К как полностью внутренне неупорядоченные белки
3.6. Структура ГО в составе Х-концевой половины ТБГ1 белка
3.7. Изменение структуры внутреннего домена белка ТБГ1 при взаимодействии с нуклеиновыми кислотами
3.8. Свойства ГО не маскируются в составе полноразмерного белка ТБГ'1
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
Названия вирусов ВВ1ЧУ (ВНКБ) - вирус некроза кормовых бобов ВГИБУ (ВШМЯ) - вирус штриховатой мозаики ячменя В8ВУ (ПТВС) - почвенно-трансмиссивный вирус свеклы ВУ<2 (ОВС) - вирус свеклы
1РСУ (ВРИА) - вирус розетчатости индийского арахиса
ЬКвУ (ВКПЛ) - вирус кольцевой пятнистости лихниса
1ЧУМУ (ВММУ) - вирус мозаики ШсоНста velitana
РСУ (ВРА) - вирус розетчатости арахиса
РМТУ (ВКВК) - вирус курчавости верхушек катрофеля
РУХ (ХВК) - Х-вирус картофеля
РБЕУ (ПЛВМ) - полулатентный вирус мятлика
ВХУУУ (ВНПЖС) - вирус некротического пожелтения жилок свеклы
Другие сокращения
АТФ - аденозинтрифосфорная кислота АСМ - атомно-силовая микроскопия БО - белок оболочки
ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИК - инфракрасный
ИПТГ - изопропил-1-тио-Р-П-галактозид
КД - круговой дихроизм
НТФ - нуклеозидтрифосфат
нц - нитроцеллюлоза
ПААГ - полиакриламидный гель
ППСП - предельная пропускная способность плазмодесм
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
РНП - рибонуклеопротеид
ТБ - транспортный белок
ТБГ - тройной блок генов
ТФЭ - трифторэтанол
охлаждением во льду), прибавляли 0,3 мл LB-среды и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Затем клетки высевали на чашки Петри с 1,5% агаром, приготовленном на LB-среде и содержащем ампициллин (50 мкг/мл) и тетрациклин (10 мкг/мл). Чашки Петри инкубировали при 37°С около 18 часов.
Для трансформации клеток штамма Ml 5 E.coli применялась следующая методика: 0,25 мл ночной культуры высевали в 50 мл LB-среды, содержавшей канамицин в концентрации 25 мкг/мл, и выращивали при качании 200 об/мин 2-3 часа при 37°С. Затем клетки осаждали центриф)тированием в течение 15 мин при 3500 об/мин при 4°С (ротор J-20, центрифуга JA-21 фирмы «Beckman», США). Осадок ресуспендировали в 22 мл охлажденного до 4 С раствора 1 (Ш0 мМ RbCl, 100 мМ МпСЛг, 30 ацетат калия, 10 мМ СаС1г, 15% глицерин, pH 5,8) и выдерживали 2 часа во льду. Затем повторно центрифугировали при 3500 об/мин в течение 15 мин, осадок ресуспендировали в 4 мл раствора2 (10 мМ RbCl, 10 мМ MOPS, 75 мМ СаСЬ, 15% глицерин, pH 6,8) и оставляли на 30 мин при -70°С. Дальнейшие процедуры проводили аналогично, но вместо тетрациклина использовался канамицин (25 мкг/мл).
Экспрессия генов рекомбинантных белков
Экспрессию генов белков ТБГ1 и их мутантов осуществляли в плазмидном векторе pQE-ЗО. Рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки E.coli штаммов Ml5 и JM-109, содержащих высококопийную репрессорную плазмиду pRep-4. Анализ клонов, экспрессирующих рекомбинантный белок, проводили следующим способом. Клоны выращивали в течение цочи в 3 мл среды 2хУТ. содержащем 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина. Часть ночной культуры переносили в стерильную колбу и добавляли И11ТГ (конечная концентрация 1-2 мМ) - индуктор экспрессии клонированных генов. Культуру растили 2 часа при 37°С. Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием (6000 об/мин., 10 мин.), суспендировали в буфере для образцов и анализировали методом электрофореза в 15% ПААТ с DS-NA. Отобранные клоны выращивали в течение ночи (см. выше), часть ночной культуры переносили в стерильную колбу с большим объемом среды (50-150 мл) и выращивали при 37°С до оптической плотности 0,8-0,9 (длина волны = 600 нм). Индукцию проводили в течение 2-5 часов. Клетки отделяли- от культуральной жидкости центрифугированием (6000 об/мин., 10 мин.), клетки замораживали и хранили при -70°С.