Мультиплексные методы определения вирус-индуцированной экспрессии цитокинов на основе микрочипов и ПЦР

• Автор: Плотникова, Марина Александровна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Современные представления о цитокинах

1.1.1 Классификация и функции цитокинов

1.1.2 Цитокиновые рецепторы и общий механизм внутриклеточной передачи сигнала

1.2 Цитокины как медиаторы иммунного ответа

1.2.1 Цитокины и иммунный ответ при вирусных инфекциях

1.2.2 Роль цитокинов в иммунном ответе на инфекцию вирусом гриппа

1.3 Современные методы определения цитокинов

1.3.1 Особенности проведения анализа цитокинов
1.3.2 Методы выявления цитокинов
1.3.3 Технология микрочипов
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Объекты
2.1.1 Клеточные культуры
2.1.2 Вирусы
2.2 Вирусологические методы
2.2.1 Определение инфекционной активности вируса
2.2.2 Стимуляция клеток ВГА
2.3 Иммунологические методы
2.3.1 «Сэндвич»-ИФА
2.3.2 Мультиплексный «сэндвич»-вариант МФА в формате микрочипа
2.4 Молекулярно-генетические методы
2.4.1 Экстракция РНК
2.4.2 Обратная транскрипция
2.4.3 Полимеразная цепная реакция
2.4.4 Электрофоретическое разделене ДНК в агарозном геле
2.4.5 Печать олигонуклеотидного микрочипа
2.4. б Подготовка пробы кДНК для гибридизации методом ОТ-ПЦР
2.4.7 Подготовка пробы амплифицированной мРНК для гибридизации методом OT-1VT
2.4.8 Подготовка библиотек кДНК для гибридизации с использованием набора MINT..
2.4.9 Гибридизация на олигонуклеотидном микрочипе
2.4.10 Мультиплексная ПЦР с детекцией в режиме реального времени
2.4.11 Детекция вирусной РНК методом ПЦР
2.5 Методы вычислительной биологии
2.5.1 Филогнетический анализ гена NS1 вируса гриппа типа А
2.5.2 Общие стратегии при конструировании олигонуклеотидных зондов и праймеров
2.5.3 Аначиз изображения, получаемого после гибридизации
2.5.4 Анализ результатов мПЦР
2.5.5 Статистические методы анализа
3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Выбор штаммов вирусов гриппа А и клеточной модели для изучения особенностей
экспрессии цитокинов
3.2 Разработка олигонуклеотидного микрочипа для выявления мРНК цитокинов и его применение для изучения роли белка NS1 вируса гриппа A/Kurgan/5/05 (H5N1) в индукции цитокинового ответа
3.2.1 Подбор олигонуклеотидных зондов и праймеров для мРНК цитокинов-мишеней IL-
1/3,1L-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12/3, IL-18, IFN-y, TNF-a человека

3.2.2 Создание лабораторного образца олигонуклеотидного микрочипа для анализа экспрессии цинготное и выбор условий проведения основных этапов гибридизации.
3.2.3 Выбор условий проведения основных этапов гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе
3.2.4 Оценка аналитической чувствительности олигонуклеотидного микрочипа
3.2.5 Выбор способа подготовки флуоресцентно меченой пробы для анализа на микрочипе на примере клеток А549, инфицированных вирусом гриппа A/Kurgan/5/05 (H5N1)
3.2.6 Аначиз роли белка NS1 вируса гриппа A/Kurgan/5/05 (H5N1) в индукции цитокинового ответа в клетках А549 методом олигонуклеотидного микрочипа и ОТ-ПЦР
3.3 Разработка метода определения уровня цитокинов с использованием мультиплексной ПЦР в режиме реального времени
3.3.1 Подбор праймеров и TaqMan зондов и оптимизация условий проведения реакции мультиплексной ПЦР в режиме реачьного времени для выявления IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, ILIO, IL-12ß, IL-18, IFN-y, TNF-a человека
3.3.2 Проверка валидности системы мПЦР для оценки экспрессии цитокинов
3.4 Сравнение паттернов экспрессии мРНК цитокинов в клетках А549, инфицированных вирусами гриппа A/H1N1 pdmo9, A/H3N2 и A/H5N1, методом мультиплексной ПЦР
3.5 Разработка белкового микрочипа для количественного выявления цитокинов
3.5.1 Выбор моноклональных антител и рекомбинантных цитокинов для использования
в микрочипе
3.5.2 Дизайн белкового биочипа для выявления IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IFN-y и TNF-a человека
3.5.3 Аначиз специфичности и чувствительности белкового микрочипа с помощью рекомбинантных цитокинов
3.5.4 Аначиз влияния гена NS1 вируса гриппа A/H5N1 на спектр цитоконов, секретируемых клетками МКПК метод алчи биочипа и традиционного ИФА
3.6 Анализ особенностей экспрессии цитокинов клетками А549 на уровне транскрипции и на уровне трансляции при заражении вирусом гриппа A/Califomia/07/09 (HlNlp(imo9).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Грипп — это острая респираторная вирусная инфекция, вызывающая сезонные эпидемии и периодические пандемии с высокой летальностью (ВОЗ, 2014). Для вирусов гриппа характерен высокий уровень вариабельности генома. Вследствие отсутствия корректорской активности у вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы при репликации происходит постоянное накопление мутаций, которые обеспечивают приобретение устойчивости к противовирусным препаратам и ускользание от механизмов приобретенного иммунитета. Кроме того, в процессе реассортации геномных сегментов в популяции человека могут появляться новые несвойственные ей штаммы вируса гриппа, обладающие пандемическим потенциалом. Примерами таких вирусов являются вирус «испанки» 1918 года и пандемический вирус HlNlpdmo
Вирусы гриппа человека в зависимости от филогенетической принадлежности могут существенно отличаться по своим генетическим характеристикам, обладать разной степенью патогенности и, следовательно, вызывать штамм-специфический иммунный ответ организма, одной из важнейших характеристик которого является цитокиновый статус. Цитокины — это ведущие физиологические медиаторы, вырабатываемые клетками в ответ на внешние воздействия и образующие сложную сеть взаимодействий, которые играют ключевую роль в развитии иммунного ответа и восстановлении гомеостаза (Симбирцев, 2002; Tarrant, 2010). В настоящее время показано, что вирусы гриппа типа А вызывают продукцию хемокинов (RANTES, MIP-la, МСР-1, МСР-3 и IP-10), провоспалительных (IL-1 (3, IL-6, IL-18 и TNF-a) и антивирусных (TFN-a, IFN-p) цитокинов (Julkunen et al., 2001). Существуют общие закономерности в паттерне экспрессии цитокинов при гриппе, однако для разных штаммов вируса уровень цитокинов может сильно отличаться. Наиболее ярким примером «нестандартного» проявления цитокинового профиля является гиперцитокинемия, или «цитокиновый шторм», — неконтролируемая и не несущая

флуоресцентной гибридизации in situ. Мультиплексный экспрессионный анализ генов цитокинов проводят с использованием ДНК-микрочипов.
1.3.3 Технология микрочипов
Технология микрочипов была практически одновременно разработана группами независимых исследователей в СССР (Lysov et al, 1988; Khrapko et al, 1989) и США (Kulesh et al, 1987; Masko&Southern, 1992) как способ секвенирования ДНК, основанный на гибридизации.
Биочипы представляют собой твёрдую подложку (как правило, стеклянный слайд площадью от 0,1 до 10 см2), на которой в матричном порядке в виде индивидуальных микроточек (спотов) диаметром от 10 до 500 мкм локализованы зонды для выявления мишеней в биологическом материале (Маркелов и др., 2008). В настоящее время разработаны различные типы микрочипов с иммобилизованными фрагментами ДНК и РНК, олигонуклеотидами, растворимыми или мембранными белками, пептидами, углеводами, пептидонуклеиновыми кислотами, разнообразными малыми молекулами, тканями и живыми клетками (Nakaya et al, 2007). В качестве анализируемого биологического материала также могут быть использованы практически любые субстанции (сыворотка, цельная кровь, микробиологические препараты, суспензии органических веществ, продуктов питания, почвы).
В процессе анализа с использованием микрочипов экстрагированные из биологического материала и химически меченые нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), белки или другие аналиты инкубируют с зондами на поверхности микрочипа. Далее осуществляют отмывку несвязавшихся лигандов и регистрацию процессов межмолекулярных взаимодействий с помощью флуоресцентных, люминесцентных, электрохимических и даже масс-спектрометрических методов.
Современные технологии, использующие роботизированные системы, позволяют создавать микрочипы, содержащие десятки тысяч индивидуальных зондов. Для их нанесения на микрочип используют две основные технологии: контактную или бесконтактную печать уже готовых зондов и in situ синтез