Нейраминидазная специфичность штаммов вирусов гриппа A и B, циркулировавших в России в эпидсезоны 2006-2010 гг.

• Автор: Белякова, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 168 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Структура и свойства нейраминидазы вируса гриппа

1.1. Строение вируса гриппа

1.2. Классификация вирусов гриппа. История основных пандемий

1.3. Нсйраминидаза вируса гриппа

1.3.1. Структура нейраминидазы

1.3.2. Структурно-функциональные домены нейраминидазы

1.3.3. Строение активного центра нейраминидазы

1.3.4. Механизм действия нейраминидазы вируса гриппа.
Реакция десиалирования
1.3.5. Функциональная активность нейраминидазы
1.3.6. Ферментативная активность нейраминидазы.
Методы ее детекции
1.3.7. Субстратная специфичность нейраминидаз вирусов гриппа.
Методы ее детекции
1.4. Антигенные свойства и олигосахаридная специфичность
нейраминидаз вирусов гриппа А
ГЛАВА 2. Ингибиторы нейраминидазы вирусов гриппа А и В
2.1. Спектр специфических противогриппозных препаратов в РФ
2.2. История создания химиопрепаратов с антинейраминидазной активностью
2.3. Механизм действия ингибиторов нейраминидазы
2.4. Клинические испытания ингибиторов нейраминидазы
2.4.1. Фармакокинетика и фармакодинамика ингибиторов нейраминидазы
2.4.2. Переносимость и безопасность ингибиторов нейраминидазы
ГЛАВА 3. Противовирусная активность антинейраминидазных химиопрепаратов
3.1. Чувствительность вирусов гриппа к ингибиторам нейраминидазы
3.2. Молекулярные механизмы возникновения резистентных
к ингибиторам нейраминидазы вирусов гриппа
3.2.1. ИА-зависимая резистентность.
Маркерные мутации NA вирусов гриппа
3.2.2. КА-независимая резистентность. Мутации НА, которые селекционируются под воздействием ингибиторов нейраминидазы
3.2.3. Методы определения чувствительности вирусов
гриппа к ингибиторам нейраминидазы
3.3. Антинейраминидазные химиопрепараты и их применение во время пандемии
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

РАЗДЕЛ 2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И НАБЛЮДЕНИЙ
ГЛАВА 1. Материалы и методы
1.1. Вирусы и клинический материал, использованные в работе
1.2. Методы изучения антигенных свойств штаммов вирусов гриппа
1.2.1. Изоляция штаммов вирусов гриппа из носоглоточных смывов
1.2.2. Идентификация гемагглютинирующих изолятов в РТТА
1.2.3. Субтипирование и типирование изолятов
вирусов гриппа и носоглоточных смывов методом ПЦР-РВ
1.3. Химиопрепараты — ингибиторы нейраминидазы, использованные в работе
1.3.1. Озельтамивира карбоксилат
1.3.2. Занамивира моногидрат
1.4. Вирусологические методы определения противовирусной активности ингибиторов нейраминидазы
1.4.1. Флуоресцентный метод (NA and N1 assays)
1.4.2. Изучение чувствительности штаммов вирусов гриппа А и В
к препаратам методом иммуноферментного анализа (ИФА)
1.4.3. Определение цитотоксического действия соединений
1.5. Молекулярно-генетические методы изучения чувствительности
вирусов гриппа А и В к ингибиторам нейраминидазы
1.5.1. Метод RT-PCR/RFLP с электрофоретической
детекцией продуктов рестрикции
1.5.2. Методы ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления
H274Y(H275Y) мутации нейраминидазы первого типа (N1)
1.5.2.1. Тест-система с использованием двух специфических
TaqMan зондов (Н274 и Y274)
1.5.2.2. Модифицированный метод «примыкающих проб»
(kissing probes) для эпидемического вируса гриппа
A(H1N1) и пандемического вируса гриппа A(IIlNl)v
1.5.3. Частичное секвенирование генов нейраминидазы
вирусов гриппа А и В
1.6. Метод определения активности и субстратной специфичности
нейраминидаз с помощью BODIPY-меченных олигосахаридов
1.7. Методы статистической обработки результатов
ГЛАВА 2. Изучение противовирусной активности ингибиторов нейраминидазы
вирусологическими методами
2.1. Изучение подавления нейраминидазной активности штаммов вирусов гриппа А и В в присутствии ингибиторов NA
флуоресцентным методом
2.2. Изучение подавления репродукции штаммов вирусов гриппа А и В в клетках культуры ткани MDCK в присутствии ингибиторов NA
методом ИФА
2.3. Изучение цитотоксического действия соединений
2.4. Сравнение чувствительности и специфичности вирусологических методов изучения противовирусной активности ингибиторов нейраминидазы

ГЛАВА 3. Изучение чувствительности эпидемических и пандемических штаммов вирусов гриппа к ингибиторам нейраминидазы
молекулярно-генетическими методами
3.1. Чувствительность эпидемических штаммов вируса гриппа А(НШ1) сезонов 2006-2009 гт. к озельтамивиру, оцененная различными методами на основе ПЦР.
3.2. Чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа А(НЗН2) и В сезонов 2006-2010 гг. к озельтамивиру и занамивиру, оцененная
методом частичного секвенирования гена нейраминидазы
3.3. Чувствительность пандемических штаммов вируса гриппа А(НШ1)у
к ингибиторам нейраминидазы
3.4. Изучение частоты возникновения вирусов, резистентных к озельтамивиру,
на фоне приема препарата у больных гриппом в эиидсезоны 2006-2010 гг
3.4.1.Оценка риска формирования маркерных мутаций нейраминидазы вирусов гриппа А и В на фоне приема озельтамивира во время эпидемического подъема заболеваемости гриппом в сезоне 2006-2007 гг
3.4.2. Идентификация и исследование чувствительности вирусов гриппа А и В к озельтамивиру, выделенных из носоглоточных смывов
от пациентов, принимавших курс препарата, в эпидсезоне 2007-2008 гг..
3.4.3. Изучение чувствительности к озельтамивиру штаммов вируса гриппа А(Н1Ш)у, вызвавших новую пандемию в сезоне 2009-2010 гг., и ПЦР диагностика их в носоглоточных смывах от пациентов
на фоне приема препарата
ГЛАВА 4. Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидаз
штаммов эпидемического и пандемического вирусов гриппа А
4.1. Субстратная специфичность нейраминидазы эпидемических штаммов вируса гриппа А(НШ1), чувствительного и резистентного к озельтамивиру, выделенных от больного в динамике лечения препаратом
4.2. Субстратная специфичность нейраминидазы пандемических штаммов вируса гриппа А/ПУ-Мозсоу/01/09 (Н1Ш)зу1 и А/ПУ-Моясоху/ОЗ/ОЭ (НШЦбш!
4.3. Субстратная специфичность нейраминидазы пандемического штамма вируса гриппа А/ПУ-ОгепЬиг§/93/09 (НШ1)зу1, выделенного от больного
с летальным исходом
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

взаимодействиями между гуанидиновой группой занамивира и по-разному заряженными остатками Glul 19, Glu227 и Aspl51 в структуре активного сайта NA. Несмотря на то, что гуанидиновая группа в основном вносит вклад в общую полярность занамивира, вместе с тем она также отвечает за низкую оральную биодоступность препарата и быстрое выведение этого соединения через почки. Занамивир вводится в респираторный тракт посредством ингаляций (von Itzstein М. et al., 1993).
Так как оральный прием препарата более удобный способ поступления активного вещества в организм человека, что может способствовать более равномерному распределению ингибитора во все ткани и органы респираторного тракта, в которых потенциально может размножаться вирус гриппа, была предпринята попытка создать орально биодоступный ингибитор NA вирусов гриппа (de Jong М. et al., 2006). Используя химически стабильную карбоциклическую структуру — циклогексеновое кольцо с аминогруппой в 4 позиции, а также замену фрагмента глицерина на липофильную боковую цепочку, был создан второй мощный ингибитор NA вирусов гриппа - озельтамивира карбоксилат. В то время как возрастала общая липофильная природа соединения, что увеличивало его оральную биодоступность, уменьшалась эффективность гидрофобных взаимодействий между липофильной боковой цепью ингибитора и консервативными остатками в активном сайте NA. Но в то же время было признано, что сильно полярные заместители, такие как гуанидиновая группа, не могут быть включены в структуру этого ингибитора, хотя они, скорее всего, обеспечат благоприятные взаимодействия с консервативными остатками в условиях высокого заряда окружения активного сайта NA (Kim С. et al., 1997; Li W. et al., 1998). Таким образом, озельтамивира карбоксилат ((ЗК,411,58)-4-ацстамидо-5-амино-3-(1-этилпропоксп)-1-циклогексен-1-карбоновая кислота; GS4071; его этиловый эфир - озельтамивир, GS4104; рис.10) стал еще одним специфическим ингибитором NA вирусов гриппа А и В (Roberts N. & Govorkova Е., 2009). Его структура «подогнана» к координатам тех остатков активного центра NA, которые взаимодействуют с глицериновой цепью Neu5Ac2en (Oxford J. et al., 2002). Данное соединение лежит в основе разработки новых ингибиторов NA с гидрофобными группами (Hanessian S. et al., 2002).
Проблема низкой оральной биодоступности озельтамивира карбоксилата была разрешена синтезом его этилового эфира — озельтамивира, который выступает в качестве пролекарства для обеспечения организма человека активным веществом в процессе его широкого распространения в организме и дальнейшего метаболизма (Не G. et al., 1999).
Первые официальные сообщения о новых препаратах с антинейраминндазной активностью были сделаны Von Itzstein М. et.al. в 1993 году (занамивир) и Kim C.U. в 1997 году (озельтамивир). Их практическое применение было начато в 1999 году, при этом, озельтамивир достаточно быстро «завоевал право» препарата выбора для лечения и профилактики гриппозной инфекции в период эпидемий и создания стоков на случай