Конструирование аптамеров белков методами компьютерного моделирования

• Автор: Щербинин, Дмитрий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.09
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 93 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Аптамеры
1.1.1 Структура и применение аптамеров
1.1.2 Поиск и синтез аптамеров
1.2 Тромбин
1.2.1 Общая сведения
1.2.2 Аптамеры к тромбину
1.3 Цитохромы
1.3.1 Функции цитохромов
1.3.2 Суперсемейство цитохромов Р
1.33 Цитохром Р450 51А
1.4 Методы молекулярного моделирования
1.4.1 Метод молекулярной динамики :
1.4.2 Докинг. Исследование белок-лигандных взаимодействий
1.4.3 Виртуальный скрининг
1.4.4 Использование компьютерных методов для поиска аффинных
аптамеров
2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
2.1 Объекты
2.2 Компьютерные методы
2.2.1 Докинг
2.2.2 Молекулярная динамика
2.2.3 Расчет энергий связывания
2.3 Экспериментальные методы
2.3.1 Синтез аптамеров
2.3.2 Экспериментальная проверка сконструированных аптамеров
3 РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Анализ структур комплексов белок-аптамер и разработка стратегии

компьютерного конструирования аптамеров
3.2 Исследование взаимодействия (анти)тромбинового аптамера с
тромбином и претромбином-
3.2.1 Поиск возможных сайтов взаимодействия тромбина с аптамерами
методами молекулярного докинга
3.2.2 Исследование взаимодействия ТВА с тромбином и претромбином-
методами молекулярной динамики
3.3 Компьютерное конструирование аптамеров к цитохрому Р450 51А1
3.3.1 Поиск сайта связывания аптамеров и конструирование “узнающего “
фрагмента аптамера
3.3.2 Поиск конформации стабилизирующего участка аптамера
3.3.3 Экспериментальное тестирование
4 ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. аминокислотный остаток
ЯМР Ядерно-магнитный резонанс
CYP Цитохром Р
CYP51A1 Цитохром Р450 51А
MD Molecular Dynamics (Молекулярная динамика)
NMA Normal mode analysis (Метод нормальных мод)
РСА Primary component analysis (Метод главных компонент)
PDB Protein Data Bank
3D-QSAR 3D Quantitative structure-activity relationship
RMSD Root-mean-square deviation (среднеквадратичные отклонения)
RMSF Root mean square fluctuation (среднеквадратичные флуктуации)
SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
TBA Thrombin-binding aptamer (Тромбин-связывающий аптамер)

может проводиться с применением методов молекулярного моделирования, а энергия связывания молекул может рассчитываться методами MM-PB(GB)SA.
1.4.4 Использование компьютерных методов для поиска аффинных аптамеров
В работе [Chushak Y., 2009] была проведена попытка отбора РНК аптамеров для низкомолекулярных соединений. Предложенный в работе подход состоял из трех этапов и по своей сути воспроизводил основные стадии метода SELEX.
На первом этапе проводился выбор последовательности РНК на основе их вторичной структуры. Анализ случайно сгенерированных выборок РНК показал, что большинство последовательностей имели достаточно простые структуры, а более сложные встречались значительно реже. Кроме того, было выявлено, что высокоаффинные аптамеры термодинамически отличаются от случайных последовательностей. Исходя из этих результатов, авторами был разработан набор критериев, которые ограничивали присутствие последовательностей с слишком простыми структурными мотивами и увеличивали количество стабильных низкоэнергетических структур. Используя эти критерии, были отобраны последовательности РНК для дальнейших исследований.
На втором этапе проводилось создание трехмерных структур для отобранных олигонуклеотидов. Компьютерное предсказание третичной структуры РНК проводилось с использованием пакета Rosetta [Das R., 2007]. Дополнительно был разработан протокол последующей минимизации полученных структур с использованием полей AMBER [Case D.A., 2005]. Для учета возможной конформационной гибкости для каждой последовательности отбиралось пять структур с наименьшими энергиями. Созданная на этом этапе библиотека трехмерных структур РНК использовалась на следующем этапе подхода.
Третий шаг заключался в виртуальном скрининге пространственных структур олигонуклеотидов. Для выбора из множества молекул РНК аффинных к мишени аптамеров использовался метод молекулярного докинга, реализованный в пакете AutoDock.