Роль транскрипционных факторов Cookie Monster и Cannonball в регуляции экспрессии генов в сперматогенезе Drosophila melanogaster

• Автор: Лактионов, Петр Павлович
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 112 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Гонады в эмбриональном развитии

1.2 Морфологическое строение семенников у О. melanogaster

1.3 Генетический контроль сперматогенеза

1.4 Геномная организация семенник-специфичных генов и предполагаемые механизмы их координированной регуляции

1.5 Гены задержки мейоза

1.6 Генетические методы мечения отдельных клеточных популяций и исследования в них функций генов

1.7 Методы определения сайтов посадки ДНК-связывающих белков

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Генетическая система для запуска эктопической экспрессии трансгенов исключительно в клетках зародышевого пути
3.2 Генетическая система для проведения ОашШ в клетках зародышевого пути О.те1апо§аз1ег
3.3 Связывание Сотг с генами в семенниках у £>. melanogaster
3.4 Влияние белка Сотг на экспрессию генов
3.5 Идентификация вторичных Сотг-зависимых регуляторов транскрипции
3.6 Связывание Сотг не всегда приводит к изменению экспрессии генов
3.7 Тканеспецифичная принадлежность Сотг-связанных и Сотг-не связанных генов
3.8 Гены-мишени Сотг обогащены маркерами неактивного хроматина в недифференцированных клетках мужского зародышевого пути
3.9 Транскрипционный фактор Сотг связывается с протяженными участками хромосом у О. melanogaster
3.10 Активация генов в семенниках £). melanogaster транскрипционными факторами 1МАС и ГГ АР комплексов
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Одним из главных направлений функциональной геномики является изучение регуляторных систем, управляющих генетическими и эпигенетическими программами развития организма. Сперматогенез у Drosophila melanogaster является удобной моделью для изучения регуляции экспрессии генов в процессе клеточной дифференцировки. В семеннике дрозофилы можно легко различить все стадии развития клеток зародышевого пути - образование клеток из стволовых предшественников, пролиферацию и терминальную дифференцировку (Fuller, 1993). Терминальная дифференцировка клеток мужского зародышевого пути у D. melanogaster сопровождается перестройкой хроматина, за которой следует активация генов, необходимых для сперматогенеза (Chen et al., 2005; Chen et al., 2011). Активация генов, дифференцировки контролируется несколькими

специализированными транскрипционными факторами, которые кодируются так называемыми генами задержки мейоза и которые можно разделить на два класса - aly и can (White-Cooper, 2010). Белковые продукты генов aly-класса образуют комплекс tMAC (testis-specific meiotic arrest complex), а гены сан-класса являются семенник-специфичными паралогами (tTAF, testis-specific TBP-associated factors) генов TAF у D. melanogaster (White-Cooper, 2010). Мутации генов задержки мейоза приводят к инактивации множества генов в семенниках, неспособности клеток зародышевого пути вступить в мейоз и остановке гаметогенеза на стадии сперматоцитов (Lin et al., 1996; White-Cooper, 2010). Было показано, что на фоне мутаций по генам задержки мейоза промоторные области генов дифференцировки остаются связанными белком-репрессором Polycomb, что по всей вероятности вызывает подавление экспрессии. В работе Chen et al. [2011] была сформулирована гипотеза, согласно которой активация генов в семенниках зависит от синхронизированного действия белков tMAC и tTAF. Это предположение
основано на наблюдении о том, что в отсутствии компонентов tMAC нарушается связывание tTAF с ДНК. Однако существующие данные описывают конечный эффект мутаций, что не дает представления о механизме действия и конкретной роли этих транскрипционных факторов в регуляции активности генов. В первую очередь остаются невыясненными гены-мишени белков, кодируемых генами задержки мейоза. Более того, до сих пор не определено, являются ли эти белки прямыми активаторами или подавляют активность генов-репрессоров в клетках зародышевого пути. Также остается открытым вопрос о том, каким образом эти транскрипционные факторы участвуют в эпигенетической регуляции активности генов. Ответы на эти вопросы позволят приблизиться к пониманию принципов работы регуляторных систем, управляющих генетическими программами дифференцировки клеток зародышевого пути D. melanogaster.
В представленной работе для исследования роли транскрипционных факторов, кодируемых генами задержки мейоза, на первом этапе были установлены гены-мишени транскрипционного фактора Cookie monster (Comr), кодируемого геном, относящимся к aly классу. Картирование Comr проводили методом тканеспецифичного DamID с последующим анализом методом микрочипов в масштабе генома. Анализ данных о локализации сайтов связывания Comr и экспрессии генов в семенниках мутантов по генам cookie monster (aly класс) и cannonball {сап класс) позволил установить роль транскрипционных факторов Comr и Cannonball (Сап) в регуляции экспрессии генов при дифференцировке клеток мужского зародышевого пути и сформулировать гипотезу относительно механизмов активации генов, необходимых для дифференцировки мужских гамет у D. melanogaster.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы являлось изучение роли транскрипционных факторов Cookie Monster (Comr) и Cannonball (Сап) в регуляции активности
1.6 Генетические методы мечен ия отдельных клеточных популяций и исследования в них функций генов
Значительный прогресс в области изучения биологии развития дрозофилы во многом связан с разработкой методик, позволяющих проводить генетические манипуляции в отдельной клеточной популяции организма, не затрагивая при этом остальные клетки. Такие методики позволяют проводить генетическое мечение отдельных клеточных популяций или прослеживать клеточные поколения, берущие начало от одной клетки-предшественника. Генетические системы для прослеживания клеточных поколений также используются для активации трансгенов или создания мутаций по генам исключительно в заданной популяции клеток. В общем смысле, действие упомянутых генетических систем направлено на создание мозаичного организма, в котором присутствуют клетки различного генотипа.
Действие этих систем основано на способности специальных ферментов-рекомбиназ осуществлять обмен гомологичными участками хромосом по определенным сайтам узнавания. В экспериментах чаще всего используется либо FLP-рекомбиназа, которая распознает специфические участки ДНК, называемые FRT-сайтами, либо Сге-рекомбиназа, способная осуществлять рекомбинацию по особым /охР-сайтам (Golic, Lindquist, 1989; Siegal, Hartl, 1996; Martin et al., 2002). Компоненты FLP/FRT-системы рекомбинации исходно были обнаружены у дрожжей S. cerevisiae, а Сге/1охР-системы - у бактериофага PI (Abremski, Hoess, 1984; Golic, Lindquist, 1989). Для проведения рекомбинации на первом этапе сайты узнавания фермента внедряют в один и тот же геномный локус гомологичных хромосом и индуцируют экспрессию трансгена, кодирующего рекомбиназу. В ходе метафазы митоза гомологичные хромосомы сближаются, и под действием рекомбиназы происходит обмен фрагментами по сайтам узнавания (Liu, Нои, 2008). При помощи систем рекомбинации также можно осуществлять