Механизмы регуляции длины теломер и дистанционных регуляторных взаимодействий у Drosophila melanogaster

• Автор: Мельникова, Лариса Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 279 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ТЕЛОМЕРЫ: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ

1.1 Тепомеры, их типы и функции

1.2 Структура теломер Drosophila в сравнении с другими организмами

1.3 Кэппинговый комплекс теломер

1.4 Теломерный гетерохроматин

1.5 Теломер-ассоциированые последовательности (TAS)

1.6 PcG белки и их роль в теломерном сайленсинге
1.7 Роль piPHK в гомеостазе теломер Drosophila
1.8 Гипотезы об эволюционной связи между теломерами дрозофилы и теломерами, использующими теломеразу
2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ РЕГУЛЯТОРНЫМИ ЭЛЕМЕНТАМИ ГЕНОМА
2.1 Промоторы: основные характеристики и типы
2.2 Энхансеры: функции, отличительные признаки и методы идентификации
2.3 Взаимодействия между энхансером и промотором: возможные механизмы и влияющие факторы
2.4 Дистанционные взаимодействия, в которые вовлечены сайленсеры
2.5 Дистанционные взаимодействия с участием инсуляторов
2.6 Отличительные особенности инсуляторов у Drosophila и дрожжей
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. РЕАКТИВЫ
2. ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ, БАЗЫ ДАННЫХ
3. СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИЙ, ДРОЖЖЕЙ И КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК Drosophila melanogaster
4. ЛИНИИ И МУТАЦИИ Drosophila melanogaster ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ
5. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
5.1 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий
5.2 Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite
в трансгенных линиях
5.3 Поддержание хромосом с терминальными делециями в линиях дрозофил
5.4 Генетические скрещивания
6. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Работа с ДНК
6.1 Выделение ДНК из дрозофилы
6.2 Саузерн-блот анализ
6.3 Приготовление компетентных клеток для трансформации_плазмидной ДНК
6.4 Трансформация компетентных клеток плазмидами
6.5 Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
6.6 Полимеразная цепная реакция
6.7 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
6.8 Лигирование ДНК
6.9 Тупление выступающих концов ДНК
6.10 Агарозный гель-электрофорез
6.11 Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций
6.12 Определение нуклеотидной последовательности
6.13 Создание рекомбинантных генетических конструкций для получения трансгенных линий Drosophila
6.14 Введение радиоактивной метки в ДНК-зонд
Работа с РНК
6.15 Выделение тотальной РНК
6.16 Нозерн блот анализ
Работа с белками
6.17 Оценка уровня экспрессии р-галактозидазы в трансгенных линиях Drosophila
6.18 Синтез и выделение белков
6.19 Электрофорез белков в денатурирующем 8% ПААТ
6.20 Вестерн блот анализ
6.21 Получение ядерного лизата из S2 клеток
6.22 Иммунопреципитация и выделение ядерного матрикса
6.23 Тестирование взаимодействий между белками в системе in vitro
Работа с дрожжами
6.24 Культивирование дрожжей
6.25 Трансформация дрожжевых клеток
6.26 Анализ взаимодействий в дрожжевой двугибридной системе
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ТЕЛОМЕРНОГО ХРОМАТИНА И МЕХАНИЗМА
РЕГУЛЯЦИИ ДЛИНЫ ТЕЛО МЕР У Drosophila melanogaster
1.1 Функциональное разделение генетических факторов Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc))

Выбор базовой модельной системы для сравнения свойств мутаций Telomere elongation (Tel) и
Enhancer of terminal gene conversion (E(tc))
Получение линий дрозофилы, несущих терминально делегированные хромосомы и аутосомы
из линии Gaiano
Анализ природы производных линий, полученных на фоне мутации Tel
Анализ соотношения частоты терминальной генной конверсии и присоединений мобильных
элементов к концу хромосомы в созданной модельной системе
Функциональное сравнение генетических факторов Tel и E(tc), участвующих в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster
1.2 Белок НР1 (Heterochromatin Protein 1) участвует в регуляции удлинения теломер у
Drosophila melanogaster
Мутации Su(var)2-5 не активируют терминальную генную конверсию, если матрица для
конверсии находится на гомологичной хромосоме
Мутации Su(var)2-5 значительно увеличивают частоту терминальной генной конверсии, если матрица для синтеза ДНК находится на той же самой хромосоме
1.3 Белки Ки70 и Ки80 участвуют в регуляции удлинения теломер у Drosophila
melanogaster
Влияние Ku белков на присоединение НеТ-А и ТАЯТ элементов к концам терминально
делегированных хромосом
Влияние Кц белков на эрозию терминальных делеций
Влияние Ku белков на терминальную генную конверсию, когда матрица для конверсии
находится на гомологичной хромосоме
Влияние Ku белков на терминальную генную конверсию, когда матрица для конверсии
находится на самой терминально делегированной хромосоме
Рекомбинация между прямыми повторами на конце терминально делегированной хромосомы.

Транскрипция НеТ-А элементов на фоне DfKu70 и DfKu
Роль белков НР1, Ки70 и Ки80 в элонгации теломер у Drosophila melanogaster
1.4 Влияние терминального хроматина на Polycomb-зависимую репрессию
Выбор базовой модельной системы для изучения свойств Polycomb-зависимого хроматина.

Получение терминально делегированных хромосом, содержащих Р-элемент в
предпромоторной области гена yellow
Анализ рЬр|-зависимой репрессии в полученных производных линиях Drosophila
melanogaster
Антогонизм между теломерным и Polycomb - зависимым хроматином на конце терминально делегированных хромосом у Drosophila melanogaster
1.5 Влияние терминального хроматина на частоту вырезаний Р-элемента
Klattenhoff and Theurkauf, 2007). Было показано, что теломерные ретроэлементы дрозофилы, так же как и другие паразитирующие элементы, являются мишенями механизма piPHK-опосредованного сайленсинга (Savitsky et al., 2006; Shpiz et al., 2009; Shpiz et al., 2007). Экспрессия и частота транспозиций теломерных ретроэлементов негативно регулируются в зародышевых клетках самок компонентами механизма piPHK Spn-E и Auberggine (Savitsky et al., 2006). Другими словами, усиленная экспрессия теломерных элементов у мутантных мух кореллирует с увеличением частоты их транспозиций и, соответственно, с элонгацией теломер. Эти данные были получены в результате экспериментов в модельной системе, основой которой являются терминально делетированные хромосомы дрозофилы. Однако в линиях, несущих мутации spn-E или aub , не было обнаружено тотального увеличения НеТ-А или TART в геноме (Savitsky et al., 2006; Khurana et al., 2010). Это может означать, что укороченные концы хромосом являются более предпочтительной мишенью для присоединения теломерных мобильных элементов, чем нормальные теломеры. Недавние исследования выявили увеличение количества НеТ-А копий в мутантных по компонентам piPHK механизма armi и ago3 линиях (Khurana et al., 2010). Эти данные подтверждают участие piPHK механизма в контроле удлинения теломер у Drosophila. Как уже упоминалось ранее, компоненты теломерного хроматина, например НР1, также играют важную роль в регуляции элонгации теломер дрозофилы. Было показано, что специфичный для зародышевых клеток гомолог НР1 Rhino необходим для продуцирования piPHK и сайленсинга транспозонов, включая теломерные элементы (Klattenhoff et al., 2009). В геноме мутантов по гену rhi были обнаружены более длинные, чем в норме, теломеры (Klattenhoff et al., 2009). Эти данные свидетельствуют, что контроль длины теломер - явление комплексное, одновременно зависящее как от компонентов хроматина, так и от piPHK механизма. Можно предположить, что правильное функционирование теломер обеспечивается взаимодействием между обоими механизмами.