Характеризация новых лейкоцитарных рецепторов человека FCRL1, FCRL4 и FCRL6

• Автор: Баранов, Константин Олегович
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 163 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Основные принципы структурной организации

лейкоцитарных рецепторов

1Л Л. Структура ИГ-домена

1Л.2. Способы закрепления лейкоцитарных поверхностных

молекул на клеточной мембране

1Л.З. Гликозилирование лейкоцитарных рецепторов

1Л.4. Сигнальные мотивы в цитоплазматических районах
лейкоцитарных рецепторов
1.2. Fc-рецепторы млекопитающих
1.2.1. Семейство лейкоцитарных FcR человека и мыши
1.2.2. Структура рецепторных комплексов лейкоцитарных FcR человека
1.2.3. Активация и инактивация клеток FcR-комплексами человека
1.3. Семейство лейкоцитарных FcR-подобных молекул - FCRL (CD307)
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы и реактивы
2.2. Биологический материал
2.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.3.1. Выделение плазмидной ДНК
2.3.2. Препаративное выделение плазмидной ДНК с помощью катионного детергента - ЦТАБ
2.3.3. Удаление примесей бактериальной геномной ДНК из раствора плазмидной ДНК при помощи кислого фенола
2.4. Методы, используемые для клонирования ДНК-фрагментов.
2.4.1. Основные методы работы с рекомбинантной ДНК
2.4.2. Приготовление и трансформация химически компетентных клеток E. coli
2.4.3. Приготовление и электропорация электрокомпетентных клеток E. coli
2.5. Полимеразная цепная реакция и олигонуклеотиды
2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.7. Дот-гибридизация ДНК
2.7.1. Приготовление радиоактивно меченых зондов
2.7.2. Гибридизация мембран с радиоактивно мечеными зондами
2.8. Получение рекомбинантных конструкций

2.8.1. Создание рекомбинантных конструкций на основе pT7ZZ
и рТ7АВР векторов
2.8.2. Создание рекомбинантных конструкций на основе рЕТ-21 вектора
2.8.3. Создание рекомбинантных конструкций на основе pCI-neo вектора
2.8.4. Создание рекомбинантных конструкций на основе pAP-tag вектора
2.9. Очистка рекомбинатных белков
2.10. Иммунизация животных
2.10.1. Иммунизация кроликов
2.10.2. Иммунизация мышей
2.11. Иммуноферментный анализ
2.12. Иммуноблоттинг
2.13. Получение моноклональных антител
2.14. Получение антипептидных антител
2.14.1. Получение конъюгата белок-пептид
2.14.2. Изготовление аффинного сорбента для очистки антител против FCRL
2.14.3. Выделение антипептидных антител из антисыворотки кролика
2.15. Транзитная трансфекция эукариотических клеток
2.16. Иммуноцитохимический анализ мазков клеток
2.17. Иммунофлуоресцентное окрашивание суспензий клеток
2.18. Иммуногистохимический анализ
2.19. Ферментативное дегликозилирование
2.20. Количественное измерение фосфатазной активности АР-содержащих белков
2.21. Создание кДНК-библиотеки миндалины человека в эукариотическом экспрессирующем векторе pcDNA I/Amp и её нормализация
2.22. Иммуноферментное окрашивание криосрезов миндалины человека и трансфицированных клеток при помощи АР-содержащих белков
2.23. Метод скрининга антител к эпитопам нативных белков
2.24. Компьютерный анализ последовательностей
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Анализ экспрессии рецепторов человека - FCRL1, FCRL4 и FCRL
3.1.1. FCRL
3.1.1.1. Экспрессия FCRL1 в тканях человека
3.1.1.2. Получение поликлональных и моноклональных антител kFCRLI
3.1.1.3. Анализ экспрессии белка FCRL1 в клетках и тканях человека

3.1.2. FCRL
3.1.2.1. Экспрессия FCRL4 в тканях человека
3.1.2.2. Получение поликлональных и моноклональных антител
к FCRL
3.1.2.3. Анализ экспрессии белка FCRL4 в клетках и тканях человека
3.1.3. FCRL
3.1.3.1. Получение поликлональных и моноклональных антител
к FCRL
3.1.3.2. Анализ экспрессии белка FCRL6 в клетках и тканях человека
3.2. Поиск лигандов к FCRL1 и FCRL
3.2.1. Получение молекулярных зондов на основе FCRL и плацентарной щелочной фосфатазы
3.2.2. Выявление связывающих FCRL1 и FCRL4 клеток в миндалине человека и экспрессионное клонирование
потенциального лиганда FCRL
3.3. Разработка метода скрининга антител к эпитопам нативных белков
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

располагаются на хромосоме 1. FCGR2, FCGR3 и FCER1 кодируют низкоаффинные FcR к IgG (FcyRII, FcyRIII) и высокоаффинный FcR к IgE (FceRI), соответственно. Четвертый ген CD16-2 структурно наиболее близок к FcyRIII человека и функционально мало изучен. Экзон-интронная организация у лейкоцитарных генов FcR является сходной с таковой у человека: два экзона, кодирующих сигнальный пептид, один экзон на каждый ИГ-подобный домен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен. Необходимо отметить высокую гомологию между лейкоцитарными FcR человека и мыши во внеклеточных участках (65-75%), остальные участки имеют значительно меньшее сходство (Ravetch and Bolland, 2001).
1.2.2. Структура рецепторных комплексов лейкоцитарных FcR человека
Из десяти описанных изоформ FcR человека, расположенных на поверхности мембраны клетки (рис. 9), только четыре содержат в цитоплазматических участках сигнальные мотивы (Muta et al., 1994). Остальные шесть изоформ не способны самостоятельно передавать сигнал о связывании с иммуноглобулином в ядро клетки, однако могут делать это за счет объединения со вспомогательными сигнальными субъединицами.
Взаимодействие FcR с сигнальными субъединицами хорошо описано на примере высокоаффинного рецептора для IgE — FceRI. FceRI рецепторный комплекс состоит из а-субъединицы (или FceRI), a также (3- и у-сигнальных субъединиц. Структурно FceRip субъединицу относят к ТМ4-надсемейству белков, пронизывает клеточную мембрану четыре раза (Kurosaki et al., 1991). В цитоплазматических областях FceRip и FceRIy имеется по одному сигнальному ITAM-мотиву (Kimura et al., 1996;