Совершенствование молекулярной диагностики холеры и сибирской язвы

• Автор: Абдрашитова, Адиля Саберьжановна
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 177 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Применение амплификационных технологий для выявления и

» идентификации возбудителя холеры

1 1.2 Применение молекулярно-генетических технологий для выявления и

идентификации возбудителя сибирской язвы

1.3 Совершенствование исследований методом ПЦР с применением

генно-инженерных технологий
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Объекты исследования
2.1.1 Штаммы микроорганизмов
2.1.2 Реактивы, питательные среды, диагностические препараты
2.2 Культивирование микроорганизмов
2.3 Подготовка проб
2.3.1 Приготовление бактериальных взвесей......................... 47 N
2.3.2 Подготовка проб биологического материала и объектов окружающей среды, искусственно контаминированных Bacillus spp. и гетерологичными микроорганизмами
2.3.3 Подготовка проб биологического материала и из объектов окружающей среды, искусственно контаминированных возбудителем
холеры и гетерологичными микроорганизмами
ч 2.3.4 Подготовка проб воды поверхностных водоемов
2.4 Выявление и идентификация холерных вибрионов из воды открытых водоемов с использованием бактериологического анализа
2.5 Обеззараживание проб
2.5.1 Обеззараживание проб, содержащих микроорганизмы рода Bacillus
2.5.2 Обеззараживание проб, содержащих V. cholerae и гетерологичные микроорганизмы

2.6 Выделение ДНК из бактериальных суспензий, проб биологического материала и из объектов окружающей среды
2.7 Полимеразная цепная реакция
2.8 Программы и базы данных для анализа нуклеотидных последовательностей
Ч 2.9 Клонирование ПЦР-продукта в вектор рСЕМ-Т, выделение
рекомбинантной плазмиды и определение её концентрации
2.9.1 Подготовка ампликонов
2.9.2 Селекция рекомбинантных клонов
2.9.3 Выделение плазмидной ДНК рекомбинантного штамма Е. соИ

2.9.4 Определение концентрации ДНК
2.9.5 Определение количества ГЭ плазмиды рОЕМ-Т со
вставкой
2.10 Статистическая обработка полученных данных
Глава 3 РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ВЫЯВЛЕНИЯ И УСКОРЕННОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ МЕТОДОМ ПЦР С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИМ И
ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ
РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1 Выбор ДНК-мишеней
3.2 Подбор специфичных праймеров к выбранным локусам и оптимизация условий амплификации с различным способом учета результатов..
3.3 Разработка стандартного образца предприятия для оценки эффективности амплификации ША и Юр А генов
Глава 4 КОНСТРУИРОВАНИЕ НАБОРОВ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ МЕТОДОМ ПЦР С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИМ И
ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ
РЕЗУЛЬТАТОВ И ОЦЕНКА ИХ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ
ЭФФЕКТИВНОСТИ
4.1 Описание тест-систем

4.2 Проведение анализа
4.3 Оценка чувствительности и специфичности созданных тест-систем в
- рамках межлабораторных испытаний
4.4 Оценка диагностической ценности сконструированного набора реагентов «Ген Vibrio cholerae - идентификация - РЭФ» в рамках
j медицинских испытаний
ГЛАВА 5 АПРОБАЦИЯ СКОНСТРУИРОВАННЫХ АМПЛИФИКАЦИОННЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ПРИ
ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ,
И ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ПРОБ ВОДЫ ОТКРЫТЫХ ВОДОЕМОВ
5.1 Идентификация штаммов холерных вибрионов
5.2 Проведение мониторинга воды поверхностных водоемов на наличие
V. cholerae
Глава 6 ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ НАБОРА РЕАГЕНТОВ «АМПЛИСЕНС® BACILLUS ANTHRACIS-FRT» В РАМКАХ МЕДИЦИНСКИХ ИСПЫТАНИЙ
6.1 Подготовка целевой коллекции штаммов бацилл для оценки эффективности нового препарата для генной диагностики сибирской язвы
6.2 Подготовка проб для проведения медицинских испытаний набора реагентов «АмплиСенс® Bacillus anthracis-FRT»
6.3 Результаты медицинских испытаний набора реагентов «АмплиСенс®
Bacillus anthracis-FRT»
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ!

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Объекты исследования
Материалом для исследования служили: бактериальные взвеси чистых культур микроорганизмов, пробы биологического материала от человека (испражнения, желчь), пробы объектов внешней среды (вода из открытых водоемов), а также искусственно контаминированные возбудителями сибирской язвы, холеры и гетерологичными микроорганизмами пробы биологического материала от человека (кровь, содержимое язвы, мокрота, испражнения), от лабораторных животных (печень, селезенка, лимфатические узлы), пробы объектов внешней среды (вода из открытых водоемов, почва, корма, молоко крупного рогатого скота).
2.1.1 Штаммы микроорганизмов
Для выполнения исследований использовали 228 штаммах микроорганизмов, из них: 112 — Vibrio cholerae; 57 - Bacillus anthracis; 4 - Bacillus cereus; 5 — Bacillus subtilis; 3 - Bacillus thuringiensis; 4 - Bacillus megaterium; 3 - Aeromonas spp.; 3 - Alcaligenes . .faecal is; 1 - Brucella abortus', 1 - Brucella melitensis; 1 - Brucella suis', 3 - Commomonas spp.', 2 - Enterococcus spp.; 7 —Escherichia coli; 3 - Plesiomonas shigelloides; 3 — Proteus vulgaris; 1 - Proteus mirabilis; 3 — Pseudomonas aeruginosa; 1 — Pseudomonas cepatica; 1 -Salmonella paratyphi A; 1- Salmonella paratyphi В; 1 - Salmonella typhi; 1 - Salmonella abdominalis; 1 —Salmonella typhimurium; 3 — Shigella dysenteriae sonnei; 3 - Shigella dysenteriae flexneri. Культуры получены из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» и ГИСК им. J1.A. Тарасевича. Краткая характеристика штаммов представлена в таблицах 2.1.-2.3. Используемые в работе штаммы были типичными по культуральным, морфологическим, биохимическим, серологическим и генетическим свойствам.
Апробация сконструированных амплификационных тест-систем проведена на 177 штаммах холерных вибрионов, выделенных на территории Российской Федерации в период с 2009 по 2012 гг. (Таблицы 2.4., 2.5.)